使用二维cDNA文库的基因表达解析方法技术

本发明专利技术提供用于取出每1个细胞并解析、同时在保存组织的二维信息的形态下定量监视各种基因的表达量的方法和/或手段。具体而言，本发明专利技术提供在保持活体组织内的二维细胞分布信息的形态下，由mRNA制备cDNA文库、以1个细胞水平的位置分辨能力获得任意的或作为对象的所有位置的基因表达量的方法。更具体而言，在保持活体组织内的二维细胞分布信息的形态下，由mRNA制备薄片状的cDNA文库，将其重复，用于基因表达的检测步骤，从而能够高精度地对多个基因计测表达分布。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及基因表达解析方法。具体而言，涉及由样品所含的核酸制备CDNA文库、解析样品中的基因表达谱的方法。
技术介绍
在基因表达解析中使用如下方法由细胞群之中取出mRNA，制备互补链cDNA，利用聚合酶链反应(PCR)等扩增该拷贝数后，使用DNA探针阵列(DNA芯片)，在对应的探针位置捕获靶标，检测荧光。但是，使用PCR扩增、DNA芯片的方法定量分析精度低，期待一种精 度高的基因表达谱分析方法。随着人类基因组解析的完成，定量研究基因表达的要求越来越强烈，最近则期待由I个细胞提取mRNA并进行定量分析的方法。定量性好的分析方法是定量PCR，其为如下的方法准备具有与靶标相同的DNA序列的标准试样，在相同条件下进行PCR扩增，通过荧光探针监视扩增的进行情况并进行比较，从而进行定量分析。就靶标而言，在I个细胞的情况下，存在的mRNA数量原本就少，难以进行定量分析。此外，为了进行多个基因表达的定量分析，需要将试样分开，分别独立地进行定量分析。当作为对象的基因数量众多、含有表达量少的基因的情况下，还存在由于分开试样而无法测定的情况。在这样的状况下，专利技术人等考虑了如下的方法制备将全部mRNA转变成cDNA并将其保持在珠子上的cDNA文库(含有全部cDNA的cDNA集合体)，并用于定量分析(专利文献I)。在此，通过重复利用cDNA文库，可以去除试样分开所致的微量表达基因的计测误差，能够准确计测I个细胞中所含的多个基因的表达量。但是，对于活体组织而言，现状是只存在由多个细胞取出mRNA并解析的技术。保持活体组织的二维形状的形态下的基因表达解析，是使用荧光探针监视I或2个左右的mRNA来进行的。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开2007 - 319028号公报
技术实现思路
专利技术要解决的问题对再生医疗、使用基因的诊断、或生命现象的基本理解而言，不仅重视组织的平均的基因表达量，而且重视对构成组织的每I个细胞中的基因的表达进行定量分析。为此，希望取出每I个细胞进行解析同时在保持组织的二维信息的形态下定量监视各种基因的表达量，但现状却是没有较好的方法。在对象基因为I或2个的情况下，能够利用使用了荧光探针的标记观测组织中的基因表达，但不可能观察多个基因的表达量。通常认为，理想的是，在形成二维或三维的结构体的活体组织中，若能在I个细胞水平下在保持细胞的位置信息的形态下计测活动的基因(mRNA)，则能够详细地获知包括细胞间的相互作用在内的活体内发生的各种现象，对生命科学领域、尤其是医疗或药物开发领域影响较大。这样就要求由多个细胞的平均的信息获得I个细胞的信息，掌握生命活动，进而并非仅对I个细胞而是对多个细胞群中每I个细胞进行分析。解决问题的手段 本专利技术人为了解决上述问题进行了深入研究，结果开发了一种方法，其在保持活体组织内的二维细胞分布信息的形态下，由mRNA制备cDNA文库，以I个细胞水平的位置分辨能力，对任意的或作为对象的所有位置的基因表达量进行分析。即，发现通过制备对应于二维地扩展的组织内的各细胞或细胞的部位的cDNA文库薄片，并将其用于基因表达解析，能够解决上述问题。具体而言，本专利技术包含以下的(I) (27)。(I) 一种基因表达谱的解析方法，其特征在于，包括(a)使样品中的待测核酸与二维地分布且固定在支持体上的核酸探针杂交的步骤，(b)合成具有与待测核酸的序列互补的序列的cDNA，在该支持体上制备二维cDNA文库的步骤，(C)使用二维cDNA文库，检测样品中的基因表达的步骤。(2)根据(I)所述的方法，样品含有多个细胞，对每个细胞解析基因表达谱。(3)根据(I)或(2)所述的方法，样品含有多个细胞，解析每个细胞的基因表达谱，比较细胞间的基因表达谱。(4)根据(I) (3)中任意一项所述的方法，样品为活体组织样品，在保存构成活体组织样品的细胞的二维位置信息的状态下，制备二维cDNA文库。(5)根据(I) (3)中任意一项所述的方法，样品为活体组织样品，在保存构成活体组织样品的细胞的内部的二维位置信息的状态下，制备二维cDNA文库。(6)根据(4)或(5)所述的方法，活体组织样品为组织切片样品，通过使该组织切片样品中的待测核酸移动到支持体，使其与核酸探针杂交。(7)根据(6)所述的方法，待测核酸向支持体的移动是通过电泳进行的。(8)根据(I) (7)中任意一项所述的方法，样品为二维地保持有各个细胞的阵列。(9)根据(I) (8)中任意一项所述的方法，待测核酸选自由信使RNA (mRNA)、非编码RNA (ncRNA)和DNA、以及它们的片段组成的组。(10)根据(9)所述的方法，待测核酸为mRNA，核酸探针为含有多聚T序列的DNA探针。(11)根据(I) (10)中任意一项所述的方法，支持体为选自薄片、膜、凝胶薄膜、毛细管板和珠子组成的组中的至少I种。(12)根据(I) (11)中任意一项所述的方法，支持体具有二维地划分而成的多个微细空间。(13)根据(12)所述的方法，微细空间的间隔比细胞的尺寸更小。(14)根据(12)或(13)所述的方法，二维cDNA文库是cDNA被保持在支持体的二维地划分而成的多个微细空间中的文库。(15)根据(I) (14)中任意一项所述的方法，还包含如下步骤使保持在二维cDNA文库中的cDNA移动至第2支持体，并使其与二维地分布且固定在第2支持体上的、具有与该cDNA或其片段互补的序列的核酸探针杂交，从而制备第2 二维cDNA文库。(16)根据(I) (15)中任意一项所述的方法，还包含如下步骤生成与保持在二维cDNA文库中的cDNA对应的核酸片段，在保持有二维cDNA文库的二维位置信息的状态下，使该核酸片段移动至第2支持体，从而制备第2 二维cDNA文库。(17)根据(16)所述的方法，与cDNA对应的核酸片段含有cDNA的互补序列。(18)根据(16)所述的方法，与 cDNA对应的核酸片段含有cDNA的互补序列和与cDNA的序列没有关联的已知序列。(19)根据(I) (18)中任意一项所述的方法，使对检测对象的基因为特异性的标记核酸探针与保持在二维cDNA文库中的cDNA杂交，基于其标记检测基因表达。(20)根据(19)所述的方法，标记为荧光标记或化学发光标记。(21)根据(I) (18)中任意一项所述的方法，使对检测对象的基因为特异性的核酸探针与保持在二维cDNA文库中的cDNA杂交，进行该核酸探针中所含的核酸序列的扩增反应，基于其扩增产物检测基因表达。(22)根据(21)所述的方法，扩增反应为聚合酶链反应(PCR)。(23)根据(I) (18)中任意一项所述的方法，使对检测对象的基因为特异性的核酸锁式探针与保持在二维cDNA文库中的cDNA杂交,通过连接反应使已杂交的锁式探针形成环状的探针，以该环状探针为模板，进行滚环扩增(RCA)反应，基于其扩增产物检测基因表达。(24)根据(21) (23)中任意一项所述的方法，利用荧光或化学发光检测扩增产物。(25)根据(I) (24)中任意一项所述的方法，重复使用二维cDNA文库，进行基因表达的检测步骤。(26)根据(I) (25)中任意一项所述的方法，还包含如下步骤比较二维cDNA文库的基因表达的检测结果和样品的二维位置信息，获本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：白井正敬，神原秀记，谷口妃代美，
申请(专利权)人：株式会社日立制作所，
类型：发明
国别省市：