本发明专利技术涉及家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子－Ｉ口服降血糖的方法，其利用重组杆状病毒在昆虫体内特别在家蚕内表达、生产重组人类胰岛素生长因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ），并用所生产的人类胰岛素生长因子－Ｉ通过口服给与途径，被动物所吸收而降低动物体内的血糖水平，达到控制高血糖，治疗人类糖尿病的目的以及提高免疫力，促进肌肉生成和生长发育等作用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和生物制药领域，具体而言，特指用家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子-I口服降血糖的方法，其将人类胰岛素生长因子-I(简称IGF-I)经口服给予动物，经消化系统吸收后，发挥IGF-I的生理功能，降低动物血液中的血糖浓度，以治疗糖尿病。
技术介绍
成熟的IGF-I是由70个氨基酸组成的多肽，分子量约为7.5kD，人体中的IGF-I主要有肝脏合成和分泌。在动物机体中IGF-I主要有两大类重要的生理功能一为胰岛素作用相似的代谢效应，即刺激动物组织吸收葡萄糖，促进糖原和脂肪的合成，降低血液中血糖的浓度；另一个功能主要促进有丝分裂作用，即通过刺激核酸和蛋白质的合成，促进细胞增殖从而促进动物的生长和肌肉的生成(Sehoenle，E et al，Nature.1982，296252)。最新研究表明IGF-I还有促进淋巴细胞增生，调节T细胞的分化，提高机体的免疫功能的作用(Tritos，NA et al，Am.J.Med 1998，10544-57)，还有报道IGF-I注射可促进骨软化，提高骨钙素生成等机能，提示可用于治疗骨质疏松症(Rosen，CJ et al，Bone.1997，21217-223)。IGF-I目前最有治疗效果的疾病是糖尿病。IGF-I的功能与胰岛素基本一致，而且IGF-I是通过IGF-I特异性受体进而刺激机体吸收血糖的能力。因此，可以避免胰岛素受体功能的早期缺陷，治疗由胰岛素受体和受体后障碍所引起的极度胰岛素抵抗性的糖尿病。但是上述治疗均是用IGF-I注射法所进行的，频繁的注射IGF-I不仅给病人造成痛苦，而且极大地增加了由于注射所引起的血液感染及传染病发生的机率。而且针剂产品的纯化及生产所要求的成本和要求均比较高。IGF-I在大肠杆菌、哺乳动物细胞及昆虫细胞中均有表达的报告，但是在哺乳动物细胞中的表达量低、成本太高。而在大肠杆菌表达系统中，必须采用融合表达并且须在大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株中才能检测到免疫学活性(李伯良等，生物化学与生物物理学报。1994，26153-160)。故存在着活性差、表达量低、产物的后加工性不佳等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子-I口服降血糖的方法。家蚕表达的IGF-I基因工程产品经初步纯化后，口服给予动物，被动物消化系统吸收后，在机体内发挥IGF-I的生理功能，达到降低血糖浓度的目的。本专利技术的目的是通过下述方法所实现其特征在于将完整的人类胰岛素生长因子基因克隆于杆状病毒转移载体，制备相应的载体DNA，与亲本病毒DNA在昆虫宿主细胞内进行共转体，产生重组病毒，经筛选获得含类胰岛素生长因子基因的重组病毒并感染家蚕进行表达，用在家蚕中生产的人类胰岛素生长因子-I，经口服给予人类和动物进行降血糖治疗。本技术方案所述的最优昆虫宿主是家蚕，所述的最优杆状病毒是家蚕杆状病毒BmNPV，最优的感染宿主时期是家蚕五龄期幼虫和蛹期，感染方法为经皮肤穿刺接种。所述的杆状病毒转移载体是pVL1393和pBm030，所述的含类胰岛素生长因子基因的重组病毒为重组家蚕杆状病毒rBmNPV-(IGF-I)。所述的口服治疗的动物为牛、羊、猪、马、鸡等主要的家畜、家禽、鱼类。本技术方案所述的家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子-I经口服后可提高其免疫力，对幼年动物肠道发育有促进作用，对动物还具有促生长和促进肌肉生成的作用。本专利技术采用基因表达技术，将来源于各种生物(人、家禽、家畜、鱼、类等)的类胰岛素生长因子基因构建到各种病毒运载载体中，使类胰岛素生长因子基因在杆状病毒的强启动子如多角体蛋白基因启动子、p10基因启动子、IE-1基因启动子或其它病毒基因和真核生物基因启动子的控制之下，通过体内或体外(in vivo/in vitro)重组，将IGF-I基因整合到杆状病毒基因组中，并使之在上述的强启动子的正确控制之下，得到重组病毒。重组病毒可通过经口或各种手段透过表皮，进行血液感染宿主并生产IGF-I基因工程产品，生产的基因工程产品可通过口服途径，在生物机体内发挥IGF-I的正确生理功能。本专利技术中的最优化方案是将来源于人的IGF-I的cDNA序列经家蚕杆状病毒BamHI酶解后插入到转移载体pVL1393的BamHI位点，经酶切和PCR反应确证IGF-I基因正确地重组到转移载体pVL1393上，得到重组质粒pVL1393-IGF-I。用脂质体将pVL1393-IGF-I DNA和亲本病毒BmNPV-ZJ8 DNA进行包埋转染BmN细胞，在体内发生重组，替代基因组上的多角体蛋白基因，通过空斑筛选技术和PCR检测技术获得携带IGF-I基因且可进行表达的重组家蚕杆状病毒rBmNPV-(IGF-I)。进行不同的重组病毒株系表达水平比较、筛选，获得和固定可进行高表达的rBmNPV-(IGF-I)。将其感染家蚕细胞系或穿刺接种4-5龄期的家蚕幼虫、预蛹或蛹，可大量繁殖rBmNPV-(IGF-I)。当rBmNPV-(IGF-I)在蚕体复制时，IGF-I基因在多角体蛋白基因启动子控制下进行表达并在蚕体或蛹体内进行正确的表达产物后加工，获得有生物活性的IGF-I产物。表达产物经病毒灭活及其它杂质的去除、纯化后，用模式动物为成年的昆明小鼠进行实验，经口灌注人工诱导的高血糖昆明小鼠，测定灌注经口给予IGF-I与对照及正常昆明小鼠的血液中血糖浓度。证明家蚕生产的人类胰岛素基因产品经口服能在动物体内发挥正确的生理功能。虽然在本专利技术所采用的模式生物为小鼠，但由于所用的基因工程产品为人的类胰岛素生长因子，所以它可广泛用于人类的类似治疗。同时，由于人的IGF-I基因与牛、羊、猪、马、鸡等主要的家畜、家禽的IGF-I基因同源性非常高，有些甚至高达90％以上，则IGF-I基因工程产品同样可经口服在上述动物中应用。综上所述，本专利技术的优点在于；1.用家蚕生物反应器生产IGF-I基因工程产品表达率高。将IGF-I基因重组进入家蚕杆状病毒，通过比较、固定获得高表达的重组病毒rBmNPV-(IGF-I)感染家蚕或蛹后，IGF-I基因获得高表达，每毫升蚕血淋巴可生产30微克以上的IGF-I，且对细胞刺激生长的活力高于商用标准品，一条蚕(或蛹)可生产高达100微克(60μg)以上的IGF-I。2.用家蚕生物反应器生产IGF-I基因工程产品生物活性好。家蚕由于本身具有的激素基因之一PTTH与IGF-I基因的结构基本相同及两者的后加工过程完全一致(Atsushi，K et al，Science，1990，2471333-35)，家蚕适于表达这一类基因。因此，本专利技术中家蚕表达的IGF-I基因的活性比商用的标准品还高。3.用家蚕生物反应器生产IGF-I基因工程产品成本低，因为家蚕是目前唯一可进行大规模商业化无菌饲养的昆虫物种。4.本专利技术的家蚕生产的IGF-I基因工程产品特点在于可经口服在生物体内发挥正确的生理功能。这样不仅可以免除频繁注射所带来的痛苦，减少因针头和药物等引起的感染和血原性疾病的传播，而且可以大大降低IGF-I的生产成本。本专利技术通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本专利技术范围。四附图说明图1、重组运载转移载体pVL1393(IGF-I)的构建2、重组运载转移载体pVL1本文档来自技高网...
【技术保护点】
家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子－Ｉ口服降血糖的方法，其特征在于将人类胰岛素生长因子基因克隆于杆状病毒转移载体，制备相应的载体ＤＮＡ，与亲本病毒ＤＮＡ在昆虫宿主细胞内进行共转染，产生重组病毒，经筛选获得含类胰岛素生长因子基因的高表达重组病毒并感染家蚕进行表达，在家蚕中生产的人类胰岛素生长因子－Ｉ经口服给予人类和动物进行降血糖治疗。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张志芳，何家禄，
申请(专利权)人：江苏恒顺醋业股份有限公司，镇江可尔健生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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