在植物种子中高水平蓄积外源基因产物的方法技术

本发明专利技术人成功地开发出一种载体，该载体通过利用编码种子储藏蛋白的基因的５′－非翻译区在植物种子中高水平地表达外源基因。本发明专利技术人还利用种子储藏蛋白缺陷型突变体作为外源基因转移的靶而成功地在植物种子中高水平地蓄积外源基因产物。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
根据种子储藏蛋白的溶解度，通常可将其分为四组蛋白，即谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白。不同于其它谷物诸如小麦和玉米，水稻种子的储藏蛋白主要是谷蛋白，约占种子储藏蛋白的70-80％。每一个单倍体基因组中的谷蛋白基因群包含约10个基因，这些基因分为两类，GluA和GluB，它们在编码区内在氨基酸序列水平上具有60-65％的同源性。每类包括约5种在氨基酸序列水平上具有80％或更高同源性的基团。谷蛋白基因在胚乳中特异地表达并蓄积。谷蛋白表达的组织特异性受到非常严格调控，并且谷蛋白不在其它组织诸如叶和根中表达。除了GluA-3外，谷蛋白基因的表达通常是受到调控的；它们的mRNA水平显示下面的模式开花的5天后(第5天)出现，在约15天时达到最大值，并在之后降低。在谷蛋白基因群中GluB-1基因具有最强的启动子活性。已经分离出这样的水稻突变体，其蓄积的谷蛋白即主要的种子储藏蛋白的量降低。例如Iida等从γ射线照射过的水稻品种Koshihikari中分离出下述隐性突变体，该突变体缺乏谷蛋白酸性亚基α1，αα2或α3之一。这些表型分别受单个隐性基因(即glu1，glu2或glu3)调控。通过上述三种突变体的杂交还可获得α1，α2和α3都缺乏的突变植株(α123)(Iida，S et al.，Theor.Appl.Genet.94177-183(1997))。LGC-1(低谷蛋白含量-1)是选自用EMS处理的Nihonmasari的突变体，其具有谷蛋白水平显著减低的表型(Iida，S.et al.，Theor.Appl.Genet.87374-378(1993))。进一步鉴定出LGC-1具有谷醇溶蛋白和球蛋白的水平增高特征。LGC-1受单个显性基因调控。通过对LGC-1和α1，α 2和α3缺陷型突变体中缺陷型基因作图，显示LGC-1中突变的蛋白基因(lgc-1)和缺少α1的突变体中的突变的谷蛋白基因(glu1)位于相同的座位。使用谷蛋白(GluB)基因为探针进行的Southern杂交的结果显示，LGC-1在GluB基因或其附近包含突变。比较LGC-1和原始品种Nihonmasari抽穗(head spout)约16天后胚乳中GluB基因的表达水平，Northem印迹的分析结果显示，GluB在LGC-1中的表达显著降低。已知大豆中的大豆球蛋白是一种种子储藏蛋白。大豆球蛋白以约60kDa的前体多肽的形式产生，其中信号肽，酸性多肽和碱性多肽结合在一起；后续过程中，信号肽被切离。此后，形成亚基，其中因Asn-Gly位点的切割产生的两种多肽-即特异性酸性多肽(A)和碱性多肽(B)-通过二硫键聚合。六个这样的亚基装配成六聚体，并储藏在蛋白体(PB)中。这种六聚体由于其沉降系数(11S)的缘故也称“11S种子储藏蛋白”。大豆球蛋白亚基基于其cDNA的一级结构和其氨基酸序列的同源性，分为组I和组II。目前已知组I的亚基A1aB1b，A1bB2和A2B1a以及组II的亚基A3B4和A5A4B3。已知6个这样的亚基在大豆的大豆球蛋白中几乎是随机组合。而且，据报道衍生自大豆的大豆球蛋白的A1aB1b亚基的肽能与胆汁酸结合(Shio Makino，The FoodIndustry 39(24)77-87(1996))，这表明大豆蛋白降低血液中胆固醇水平的能力取决于A1aB1b亚基。
技术实现思路
本专利技术人集中研究大豆的大豆球蛋白的有利的生理功能，诸如上述降低胆固醇的效应，并且已成功得到一种水稻，其种子中储藏蛋白的组成已经通过在水稻种子胚乳中表达A1aB1b基因而改变(专利3030339)。然而，为了能通过食用这种水稻而产生预期的生理作用，需要高水平的表达。因此，需要开发和利用能在水稻中蓄积高水平外源基因产物的技术。本专利技术就是考虑到这些需求而进行的，本专利技术的目的是提供一种在植物种子中蓄积高水平外源基因产物的方法。为了达到以上目的，本专利技术人力图改进启动子以在植物种子中高水平表达外源基因。通过检测水稻种子储藏蛋白谷蛋白GluB-1基因的启动子区，显示出用于表达大豆球蛋白基因的常规载体未完全包含谷蛋白基因的5′-非翻译区。本专利技术人集中研究谷蛋白基因的5′-非翻译区(尚未认识到其重要性)，并检测将5′-非翻译区插入表达载体是否会改进mRNA的蓄积水平。结果显示，与常规大豆球蛋白基因转导体相比，在表达水平上没有改进，该转导体在GluB-1基因启动子和大豆球蛋白基因(A1aB1b)间插入了烟草光合基因的增强子序列(pSaDb)。然而，谷蛋白的完整5′-非翻译区的插入(ATG)显著升高mRNA和蛋白质的蓄积水平。先前的研究从未考虑到在植物中表达外源基因的基因表达(转录和翻译)的最大能力。因此，仅仅力图将外源基因导入通常用于试验的植物品种。本专利技术人集中研究植物的“最大能力”，并假定用具体蛋白质缺陷型突变体可以更高水平的蓄积外源基因产物。因此，本专利技术人尝试用突变的植物表达和蓄积外源基因。目前已知水稻中的几种缺少主要储藏蛋白的突变体，诸如LGC-1和α123。本专利技术人预计，这类种子储藏蛋白缺陷型突变体中，可用于蛋白质翻译的游离氨基酸的数量高于正常植物中的数量，因为这类游离氨基酸并未用于正常蓄积的储藏蛋白的生物合成。而且，本专利技术人认为LGC-1中谷蛋白启动子的使用能高水平表达外源基因，因为在LGC-1中谷蛋白基因的表达受到抑制，并由此可以使用最初用于谷蛋白表达的转录因子来表达外源基因。因此，本专利技术人将LGC-1或α123与大豆球蛋白转导体11-5杂交，以将大豆球蛋白基因导入该突变体，检测其种子中蓄积大豆球蛋白的水平。结果发现与11-5相比，所蓄积的大豆球蛋白的量在LGC×11-5和α123×11-5系统中显著升高。因此本专利技术人通过利用编码种子储藏蛋白的基因的5′-非翻译区成功地开发了一种在植物种子中高水平表达外源基因的载体。本专利技术人还通过利用种子储藏蛋白缺陷型突变体作为基因转移的靶而成功地在植物种子中高水平地蓄积外源基因产物，并最终由此得出本专利技术。更具体的是，本专利技术提供(1)一种在植物种子中蓄积外源基因产物的方法，包括下面的步骤将外源基因导入内源种子储藏蛋白缺陷的植物中，并在该植物中表达外源基因；(2)根据(1)的方法，其中外源基因导入使用的是一种载体，该载体包括与启动子下游操纵地连接的外源基因，所述启动子确保外源基因在植物种子中表达；(3)根据(1)的方法，其中外源基因的导入是通过与包含所述外源基因的植物杂交进行的；(4)根据(2)的方法，其中将编码种子储藏蛋白的基因的5′-非翻译区插入到外源基因和确保外源基因在植物种子中表达的启动子间；(5)根据(4)的方法，其中5′-非翻译区是完整的；(6)根据(4)或(5)的方法，其中5′-非翻译区是编码选自谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白组中蛋白的基因的5′-非翻译区；(7)根据(6)的方法，其中5′-非翻译区包含SEQ ID NO1的核苷酸序列；(8)根据(1)-(7)中任一项所述的方法，其中植物中缺陷型种子储藏蛋白选自谷蛋白，球蛋白，谷醇溶蛋白和清蛋白；(9)内源种子储藏蛋白缺陷的转化植物细胞，其中已导有外源基因；(10)内源种子储藏蛋白缺陷的转化植物细胞，其中已导入一种包括与启本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在植物种子中蓄积外源基因产物的方法，包括下面的步骤：将外源基因导入缺陷内源种子储藏蛋白的植物中，并在该植物中表达外源基因。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：高岩文雄，多田欣史，
申请(专利权)人：独立行政法人农业生物资源研究所，生物系特定产业技术研究推进机构，
类型：发明
国别省市：JP[日本]