低脂氧化酶1大麦制造技术

本发明专利技术提供了具有降低的脂氧化酶－１酶活的大麦植物，例如，表达突变型ＬＯＸ－１蛋白质的大麦植物。本发明专利技术的大麦植物用于具有提高的稳定性和降低的Ｔ２Ｎ潜力的植物产品的生产，例如麦芽和酿制的饮料，具体的是啤酒。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本申请是在植物生物
更具体地说，本申请涉及编码具有剧烈降低的9-过氧羟基十八烷酸形成活性之酶的突变型大麦脂氧化酶1基因(lox-1)。本专利技术还涉及在酿酒过程中lox-1纯合的大麦品种用于减少酿制成的产品例如啤酒在贮藏过程中异味(off-flavor)的形成的用途。
技术介绍
脂氧化酶是催化游离的和酯化的多不饱和脂肪酸的双氧化作用的一个酶家族(EC 1.13.11.12)，该多不饱和脂肪酸含有1(Z)、4(Z)-戊二烯构型。长期以来，脂氧化酶催化反应的产物被怀疑为在植物谷粒/种子和从谷粒/种子获得的食品中腐败味出现的主要原因(Robinson等，1995，Food Chem.，5433-43)。脂氧化酶涉及在大豆加工过程中产生的挥发性己醛的生产，它具有不受欢迎的香气，限制了在食品中大豆蛋白的使用。人们认为三种在大豆种子中表达的脂氧化酶同工酶有助于脂类氧化和己醛形成。为了减少己醛形成和改善它们的香味稳定性，已生产了缺乏一种或多种这些同工酶的大豆突变体。这一方法的成果已由Hildebrand等，1990，J.Agric.Food Chem.381934-1936所评估。缺乏大豆脂氧化酶3的突变体产生较高的己醛水平，表明该同工酶转化由脂类氧化产生的13-过氧羟基十八烷酸为非挥发性的产物。缺乏所有三种种子脂氧化酶的三-零大豆品系(triplenullsoybean line)的野外使用特性显示这些酶对于正常的农学和种子特性不是必需的(Narvel等，1998，Crop Sci.38926-928)。脂氧化酶还涉及水稻异味的产生，这可在谷物贮藏过程中发生。在贮藏的谷物中可检测到游离脂肪酸的释放，这是甘油三酯储备代谢的表现。发现水稻品种Daw Dam累积低水平的戊醛和己醛，该戊醛和己醛在贮存中给予较好的香味稳定性(Susuki等，1999，J.Agric.Food Chem.471119-1124)。这一希望的表型归因于水稻酯氧化酶-3的缺乏，该酯氧化酶-3氧化不饱和脂酰基链以形成9-羟基过氧化十八烷酸定位异构体。人们认为脂氧化酶途径与许多分支途径结合，并且它在植物生长和生理等许多方面的作用尚未完全了解。建议使用在种子作物中改变9-氢过氧化作用活性的修饰的脂氧化酶途径，调节它们对由曲霉属真菌(Aspergillus spp.)引起的真菌毒素的污染的敏感性(WO 9726364)，这与植物病原体抗性中包含的这种途径一致，但与这里描述的本专利技术的目的无关。在许多促成啤酒香味的植物香味挥发物中，具有6-12个碳链的高度不饱和醛具有特别低的器官感觉香味阈(Meilgaard 1975，MBAATech.Quart.12151-168)。反式-2-壬烯醛，是该类群的一个成员，具有极低的0.01ppb的香味阈值并给予啤酒令人不快的稻草样、“硬纸板”味道。由反式-2-壬烯醛引起的特征性异味是贮存1-3个月或更长的啤酒的普遍特征，并对于窖藏啤酒的香味特别有害，该窖藏啤酒是用浅色麦芽酿制并具有柔和的香味。人们早已知道亚硫酸盐改善啤酒的香味稳定性，其不仅通过结合氧并充当抗氧化剂，并且还通过形成存在于啤酒中的具有醛和酮的挥发性亚硫酸氢盐加成化合物。啤酒中亚硫酸盐的两个主要的来源是通过发酵过程中酵母经硫的同化途径产生亚硫酸盐，和在包装前将亚硫酸盐加入啤酒。增强酵母亚硫酸盐生产和分泌的发酵条件将允许从存在于麦芽汁中的羰基形成亚硫酸盐-羰基加合物，并防止它们通过酵母的进一步代谢(Dufour 1991，Proc.Eur.Brew.Conv.Congr.，Lisbon，209-216页)以这种形式羰基(例如乙醛和双乙酰)可转移到啤酒中。在啤酒熟化过程中，亚硫酸盐防止羰基化合物反式-2-壬烯醛出现的能力已通过使用一个酵母菌株酿造啤酒得以证实，其中所述酵母的硫同化途径被阻断(Johannesen等，1999，Proc.Eur.Brew.Conv Congr.，Nice，655-662)。装瓶后，通过在37℃贮存7天强制熟化啤酒，这以后发现反式-2-壬烯醛的水平大大超过味觉阈限。如果在装瓶前向低亚硫酸盐的啤酒中加入10ppm的亚硫酸盐，在强制熟化过程中反式-2-壬烯醛的出现明显减少。亚硫酸盐和羰基化合物之间的反应是可逆的，并且在热力学和动力学的控制下。亚硫酸盐化合物的表观平衡常数从羰基化合物的10-6M(例如乙醛、己醛、和癸醛)，到双乙酰和丙酮酸盐的10-3(Dufour 1991，出处同前)。在啤酒贮藏过程中，由包装而产生的气体交换将允许氧气进入啤酒造成亚硫酸盐损失，这样较弱的亚硫酸氢盐加合物将分解，使游离羰基出现在啤酒中。而亚硫酸盐毫无疑问地增强啤酒香味稳定性，特别是在短期内，在包装的啤酒中其保持力极大程度上取决于由包装而产生的气体交换和温度。在酿制的啤酒中，发酵过程中生产的亚硫酸盐的自然水平是可变的，并且装瓶前亚硫酸盐的加入不是一个普遍接受的方法。由于这些原因，亚硫酸盐独自不能提供在全世界所使用的不同的啤酒贮藏条件下增强啤酒长期的香味稳定性的可靠方法。通常公认在啤酒中发现的反式-2-壬烯醛产生自从大麦谷粒脂类衍生的多不饱和脂肪酸的氧化，其中18-碳链脂肪酸，亚油酸是最丰富的。然而，由此形成反式-2-壬烯醛的机制在文献中很少一致。已提出导致反式-2-壬烯醛从多-不饱和脂肪酸形成的酶促途径的存在，但是从没有在大麦谷粒中或麦粒发芽的过程中实验证明各个酶促步骤(Gardner 1988，Adv.Cereal Sci.Technol.9161-215)。已提出将使用反义或共抑制基因技术减少大麦谷粒中的脂氧化酶-1的水平，并因此控制9-羟基过氧化和在制成的大麦谷粒中减少乙醛和乙醇的水平的概念作为控制异味形成的方法，但是没有报道这种方法的结果(McElroy和Jacobsen，1995，Bio/Technology 13245-249)。已开发了一种强制试验作为评估啤酒反式-2-壬烯醛效能的方法，其中在麦芽汁或啤酒中反式-2-壬烯醛的形成是通过在减低的pH的条件下提高样品温度诱导的(100℃，pH 4.0持续2小时)。把麦芽汁和酿制的啤酒中的反式-2-壬烯醛的效能与干麦芽中的脂氧化酶活性的总水平联系起来的努力显示，脂氧化酶可促成反式-2-壬烯醛在熟化啤酒中的出现(Drost等，1990，J.Am.Soc.Brew.Chem.48124-131)。然而，大麦麦芽中的脂氧化酶活性在麦粒发芽过程结束时由窑干过程中酶失活的程度所调节的事实严格限制了从这一研究得出的结论。因此，仅检测了残余的麦芽脂氧化酶活性对得到的麦芽汁和酿制的啤酒中的反式-2-壬烯醛效能的影响。该研究没能评估在大麦谷粒的发育和麦粒发芽过程中催化脂氧化酶酶促途径中第一步的脂氧化酶，以及它们作为在啤酒中发现的反式-2-壬烯醛水平的决定因素的作用。实际上，缺失一种或多种脂氧化酶同工酶的大麦栽培变种的缺乏造成不可能提供关于在大麦麦芽中控制反式-2-壬烯醛的形成之脂氧化酶途径的作用的令人信服的证据。当与自动氧化/化学途径比较时，需要这样的实验以评估酶促途径对啤酒中反式-2-壬烯醛形成的贡献。酿酒过程包括麦芽汁沸腾的高温步骤，其中提出会发生这些非酶促反应(Noel等，1999，J.Ag本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包含突变型ＬＯＸ－１蛋白质的大麦植物或其部分，其中与非突变的对照相比，脂氧化酶活性减少或缺乏。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：AC多玛，A杜德勒，V卡梅隆米尔斯，B斯嘉德豪格，LM贝克，N施密特，JC海斯泰克，JR范麦其伦，
申请(专利权)人：卡尔斯伯格研究实验室，海尼根技术服务有限公司，科诺布格啤酒公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]