一种扩增血红素氧化酶基因的方法技术

本发明专利技术涉及一种扩增血红素氧化酶基因的方法，属于分子生物学和临床医学领域。本发明专利技术选择在ＧｅｎＢａｎｋ上发表的ＨＯＸ－１的编码基因，利用ＤＮＡｍａｎ生物学软件进行同源性分析，根据保守序列设计了一对简并引物。以ＣＯＰＤ吸烟患者和健康吸烟者的ＨＯＸ－１基因组ＤＮＡ作为模板，利用简并引物扩增得到蛋白酶编码基因的保守序列。本发明专利技术扩增得到的ＨＯＸ－１蛋白酶基因多态性在中国西南地区汉族人与ＣＯＰＤ的易感性有关，且携带ＨＯＸ－１Ｉ类基因型（包含有Ｌ等位基因）的个体更易感ＣＯＰＤ。本发明专利技术的方法具有快捷、简便、经济、结果更准确等优点。本发明专利技术得到的基因可指导易感ＣＯＰＤ人群避免从事一些接触煤灰、粉尘等的工作，从而减少ＣＯＰＤ的发病率，提高ＣＯＰＤ的防治水平。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种扩增血红素氧化酶(heme oxygenase -1，HOX-1)基因的方法，属于分子生物学和临床医学领域。
技术介绍
COPD是一常见呼吸系统疾病，其患病率及病死率正在逐年上升。据研究预计，2020年COPD患病率和死亡率将上升至全球疾病死亡率的第四位。但是至今在临床上仍然没有研究出一种能有效预防和根治COPD的方法，其主要原因在于对于COPD的发病机制尚不明。近十年中，COPD疾病的发病机制主要集中在蛋白酶/抗蛋白酶和氧化酶/抗氧化酶的研究上。α1-抗胰蛋白酶是目前唯一研究证实的与COPD疾病有关的抗蛋白水解酶。在COPD分子基因研究上，近年对于氧化抑制酶基因的研究较多，如谷胱苷肽S转移酶，微粒体环氧化物水解酶，血红素氧化酶，细胞色素P450酶。但是，因为血红素氧化酶基因启动子存在微卫星多态性，先前的研究使用的分子生物学技术方法-Genescan方法，技术难度大，费用高，在分子生物学和临床研究方面受到了一定的限制。经文献检索，国内未发现与本
技术实现思路
相同文献的公开报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快捷、简便、经济、结果更准确的扩增血红素氧化酶(heme oxygenase -1，HOX-1)基因的方法。本专利技术选择在GenBank上发表的不同HOX-1的编码基因，利用DNAman生物学软件进行同源性分析，根据保守序列设计出简并引物上游引物5’-ACG CCT GGG GTG CAT CAA GTC-3’；下游引物5’-GTG GGG TGG AGA GGA GCA GTC ATA-3’；扩增片段为上游引物(175bp...195bp)；下游引物(412bp...389bp)。以COPD吸烟患者和健康吸烟者的HOX-1基因组DNA作为模板，利用简并引物扩增得到蛋白酶编码基因的保守序列。本专利技术扩增得到的HOX-1蛋白酶基因多态性与COPD的易感性有关，且携带HOX-1I类基因型(包含有L等位基因)个体更易感COPD。由于HOX-1是参与COPD发病机制中的重要抗氧化酶，因此本专利技术得到的基因可指导易感COPD人群避免从事一些接触煤灰、粉尘等的工作，从而减少COPD的发病率，提高COPD的防治水平。本专利技术是这样实现的1、参照标准的苯酚/氯仿方法从血液中提取总DNAa.取150μl全血加入450μl STE缓冲液(30mM Tris-HCL，200mM EDTA，50mMNaGl，pH 8.0)和终浓度分别为1％的SDS 50μl和200μg/ml的蛋白酶K 30μl；b.充分混匀后置56℃温箱中消化24小时至澄清；c.取出样本后，先将样本离心十余秒钟，再加入等体积的水饱和酚(700μl)，放入混匀器内缓慢混匀24小时；d.取出样本后，将样本放入离心器以6000转/分离心10分钟，上清液转至另一干净的Eppendorf管中；e.加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1；即苯酚350μl，氯仿∶异戊醇350μl)混合液缓慢混匀抽提20分钟，6000转/分离心10分钟，上清液转至另一干净的Eppendorf管中；f.加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1；剂量同上)抽提10分钟，6000转/分离心10分钟，上清液转至另一干净的Eppendorf管中；g.加入等体积的异丙醇(700μl)沉淀DNA，-20℃过夜放置；h.取出样本后，将样本放入离心器以6000转/分离心10分钟后，弃上清；i.加入800μl 70％乙醇洗涤，10000转/分离心10分钟后，弃上清；j.重复一次；k.将DNA样品置于真空干燥器干燥3分钟左右(视管中乙醇残留量多少适当调整干燥时间)；l.加入适量TE(PH＝8.0)缓冲液溶解，置+4℃冰箱待用或保存于-20℃。2、PCR扩增a.PCR反应所用的引物在本实验中，我们根据Primer 5.0软件自行设计了引物HOX-1并进行扩增。引物序列如下上游引物5’-ACG CCT GGG GTG CAT CAA GTC-3’下游引物5’-GTG GGG TGG AGA GGA GCA GTC ATA-3’；扩增片段为上游引物(175bp...195bp)；下游引物(412bp...389bp)。b.PCR扩增体系PCR反应体系20μl包括基因组DNA100ng，100ng引物(大连宝生物公司)，200mmol/LdNTP，1U TaqDNA聚合酶(大连宝生物公司)。c.PCR扩增反应条件预变性 95° 5分钟， 后延伸 72° 5分钟PCR产物长度为238bp。PCR产物用3％的琼脂糖凝胶进行检测。检测时，每个样品取2μl点入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳。3.应用Genescan分析HOX-1基因启动子多态性测序前反应取PCR产物每样本1μl加入Loading Buffer(按甲酰胺∶葡聚糖∶内标4∶1∶1配制)2μl，混匀后预变性95° 5分钟后放入冰盒，保存变性状态。测序配胶步骤a.缓冲液(储存液)配制Tris108克硼酸55克EDTA7.4克加入800毫升水，搅匀后定容至1000毫升，即为储存液。b.缓冲液(工作液)配制取储存液200毫升，稀释至1500毫升，即为工作液。c.测序胶配制步骤250毫升烧杯中加入尿素(Urea) 18gH2O 25ml缓冲液(储存液) 5mlGel 5ml树脂 适量定容至50毫升，磁力搅拌器上搅拌15分钟。d.称取0.1克过硫酸胺(APS)于1.5毫升离心管中，加入1000微升水，混匀后待用。e.胶液混匀后倒入抽滤器中抽滤。f.将胶板、胶条放置在架上将“凸”形的胶板放置在架上，直推至底；将胶条放置在“凸”形胶板上，边缘对齐，两缺口向内；用枪向胶条下加少许水，以固定胶条；放置“凹”胶板，使两胶板底边对齐；夹紧夹子，放置接胶板。j.胶液中加入250微升APS，25微升TEMED，混匀。h.立即用注射器吸取胶液，打出气泡，灌入胶板中。放入梳子(无齿一面)。i.45分钟后胶液凝聚，即可点样。ABI 3770测序反应取测序前产物每样本1μl点入胶孔中，然后放入ABI PRISM 3770仪中进行聚丙烯酰胺电泳，激光扫描自动DNA测序。测序结果通过Genotype软件分析。本专利技术的方法与现有技术相比，具有快捷、简便、经济、结果更准确等优点。本专利技术得到的基因可指导易感COPD人群避免从事一些接触煤灰、粉尘等的工作，从而减少COPD的发病率，提高COPD的防治水平。具体实施例方式以下是本专利技术的实施例，但本专利技术的内容并不局限于此。实施例(本实施例的具体步骤同
技术实现思路
部分所述) 以HOX-1启动子的基因组DNA作为模板，用本专利技术的简并引物扩增得到蛋白酶的保守基因序列，再利用Genescan技术扩增未知的5′端基因序列，放入ABI PRISM3770仪中进行聚丙烯酰胺电泳，激光扫描自动DNA测序。测序结果通过Genotype软件分析。Untitled Hoxl.ST25SEQUENCE LISTING<110>云南大学<120><130>1<160>1<170>PatentIn version 3.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扩增血红素氧化酶基因的方法，包括基因组ＤＮＡ的提取、用引物进行ＰＣＲ扩增、扩增片段测序及测序结果分析步骤，其特征在于本方法中所用引物由下列方法设计得到：（１）选择在ＧｅｎＢａｎｋ上发表的索引号是Ｘ１４７８２的ＨＯＸ－１启动子的编 码基因；（２）利用ＤＮＡｍａｎ生物学软件进行同源性分析，根据保守序列设计出简并引物：上游引物：５’－ＡＣＧＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＡＴＣＡＡＧＴＣ－３’；下游引物：５’－ＧＴＧＧＧＧＴＧＧ ＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＣＡＴＡ－３’；扩增片段为：上游引物：（１７５ｂｐ…１９５ｂｐ）；下游引物：（４１２ｂｐ…３８９ｂｐ）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：戴路明，张亚平，傅炜萍，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]