免疫原性减弱的经修饰促红细胞生成素(EPO)制造技术

本发明专利技术涉及尤其是用于对人施用的、特别是用于治疗的多肽。所述的多肽是经修饰的多肽，其中，所述的修饰使得上述多肽在施用于人体时引起免疫应答的倾向减弱。本发明专利技术特别涉及对促红细胞生成素（ＥＰＯ）进行修饰以产生促红细胞生成素蛋白，该蛋白在体内使用时基本上无免疫原性，或比未经修饰的相应蛋白的免疫原性低。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及尤其是用于对人施用的、特别是用于治疗的多肽。所述的多肽是经修饰的多肽，其中，所述的修饰使得上述多肽在施用于人体时引起免疫应答的倾向减弱。本专利技术特别涉及对促红细胞生成素(EPO)进行修饰以产生促红细胞生成素蛋白变异体，该变异体在体内使用时基本上无免疫原性，或比未经修饰的相应蛋白的免疫原性低。本专利技术还涉及来自上述未经修饰蛋白的T-细胞表位肽，由此可以构建免疫原性减弱的经修饰促红细胞生成素变异体。
技术介绍
有许多例子表明治疗蛋白的效率受限于针对所述治疗蛋白的干扰性免疫反应。已有若干种小鼠单克隆抗体表现出治疗多种人类疾病的前景，但在某些情况下由于诱导出相当程度的人抗小鼠抗体(HAMA)应答而未能成功应用。对于单克隆抗体，已发展了多种技术以试图减弱HAMA应答。这些重组DNA方法通常是减少最终的抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。尽管如此，在许多个体中，所得的“人源化”抗体仍然引起患者的免疫应答。抗体并不是唯一一类作为治疗剂施用并可引起免疫应答的多肽分子。即使是来源于人且具有与人体内蛋白相同氨基酸序列的蛋白也可以在人体内诱导免疫应答。值得注意的例子包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和干扰素α2等的治疗性应用。诱导免疫应答的主要因素是在蛋白中存在可经由MHC II类分子的呈递作用激活T-细胞活性的肽(即所谓的T-细胞表位)。这种潜在的T-细胞表位通常定义为任何具有与MHC II类分子结合能力的氨基酸序列。可测定此种T-细胞表位以建立MHC结合。隐含地，″T-细胞表位″是指当其与MHC分子结合时可被T-细胞受体(TCR)识别的表位，并且至少原则上，这种表位可以通过使TCR促进T-细胞应答而激活这些T-细胞。但可以理解，某些可与MHC II类分子结合的肽可能存留在蛋白序列中，因为这种肽在施用此最终蛋白的生物中被识别为“自身的”。已知这些T-细胞表位肽中的某些可在肽、多肽或蛋白在细胞中降解的过程中释放出来，随后由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递以便引发T-细胞激活作用。对于MHC II类分子呈递的肽，这种T-细胞激活作用可，例如通过直接刺激B细胞产生抗体而引起抗体应答。MHC II类分子是一组高度多态的蛋白，其对辅助T细胞筛选和激活起重要作用。人白细胞抗原群DR(HLA-DR)是这组蛋白的主要同种型也是本专利技术的焦点所在。鉴于同种型HLA-DQ和HLA-DP行使类似的功能，本专利技术对此两者均适用。MHC II类DR分子由α和β链组成，其C-末端插入并穿越细胞膜。每一异源二聚体都具有可与长度在9到20个氨基酸范围内变化的肽相结合的配体结合结构域，但是结合沟中最多容纳11个氨基酸。配体结合结构域由α链的1-85位氨基酸和β链的1-94位氨基酸组成。最近的研究表明DQ分子具有同源的结构，预期DP家族蛋白也非常类似。在人中已发现了DR同种型的约70种不同同种异型，对于DQ有30种不同的同种异型，对于DP有47种不同的同种异型。每一个体带有2到4个DR等位基因，两个DQ及两个DP等位基因。许多DR分子的结构已阐明，这种结构指向一种带有许多疏水口袋的开口肽结合沟，所述的疏水口袋与肽的疏水残基(口袋残基)相互作用。确立不同II类分子同种异型的多态性有助于肽结合沟中的不同肽结合表面的广泛多样性，并且在群体水平保证有关识别外来蛋白和引发针对病原生物免疫应答的最大灵活性。在配体结合结构域内存在相当数量的多态性，并且在不同地域和种族群体存在着显著不同的“家族”。这一多态性影响着肽结合结构域的结合特性，因此，不同的DR分子“家族”对不同序列属性的肽具有特异性，但也可以有一些重叠。这种特异性决定了最终负责驱动针对B细胞表位的抗体应答的Th-细胞表位识别(II类T-细胞应答)，所述的B细胞表位存在于衍生所述Th-细胞表位的相同蛋白上。因此，个体中针对蛋白的免疫应答在很大程度上受到T-细胞表位识别作用的影响，这种识别作用是个体中与HLA-DR同种异型的肽结合特异性的函数。因而，为对全球种群背景下的肽或蛋白中的T-细胞表位进行鉴定，需要考虑到尽可能多样的HLA-DR同种异型组的结合特性，由此覆盖尽可能高比例的世界上的种群。针对治疗性蛋白(如本专利技术的目的蛋白)的免疫应答通过MHC II类肽呈递途径进行。其间外来蛋白经吞噬和加工后与DR、DQ或DP型MHC II类分子结合以进行呈递。MHC II类分子由专门抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞、树突状细胞等表达。通过在T细胞表面的关联性T-细胞受体与MHC II类肽复合物相互作用，加之与某些其他共同受体，如CD4分子交联可诱导T-细胞进入激活状态。上述激活作用可导致细胞因子释放，进一步激活其他淋巴细胞如B细胞，产生抗体或激活T杀伤细胞形成完整的细胞免疫应答。肽与给定的MHC II类分子结合以备在APC表面呈递的能力依赖于多种因素，最主要的是肽的一级结构。这影响其蛋白酶剪切倾向及其在MHC II类分子的肽结合隙中的结合亲和性。在APC表面的MHC II类/肽复合物向能识别决定簇的特定T-细胞受体(TCR)呈递一个结合面，其中所述决定簇由肽和MHC II类分子的暴露残基共同提供。本领域中有鉴定能结合MHC II类分子的合成肽的方法(例如WO98/52976和WO00/34317)。这种肽不是在所有情况下都行使T细胞表位的功能，特别是在体内会受加工途径和其他现象的影响。T-细胞表位鉴定是表位清除的第一步。鉴定及从蛋白中去除潜在T-细胞表位先前已有公开。本领域中已有检测T-细胞表位的方法，通常是通过计算机手段在经试验确定的T-细胞表位中扫描公认的序列基元，或利用计算机技术预测MHC II类结合肽，特别是DR-结合肽。WO98/52976和WO00/34317中公开了鉴定具有与人MHC II类DR同种异型亚群结合的潜在能力的多肽序列的计算机穿线方法(computational threading approaches)。这些教导中，通过在人源或非人源治疗性抗体或非抗体蛋白一级序列中进行准确的氨基酸替换以去除预测的T-细胞表位。此外，利用重组MHC分子与合成肽的可溶性复合物(该复合物能与来自于人或受试实验动物外周血液样品中的T-细胞克隆相结合)的技术也在本领域中有所应用，这些技术也可以用于表位鉴定策略中。根据上述描述，由此可能期望鉴定、去除或至少减少给定的具有重要的治疗价值但原本具有免疫原性的肽、多肽或蛋白中的T-细胞表位。EPO是这些有治疗价值的分子之一。EPO是参与红细胞前体成熟为红细胞的糖蛋白激素。天然的EPO由胎儿肝脏和成人的肾脏产生，其在血液中循环并刺激骨髓中红细胞的产生。贫血症几乎是肾衰竭的必然结果，这是由于从肾脏产生的EPO减少了。重组EPO可用于有效地治疗由慢性肾衰竭所导致的贫血症。具有人促红细胞生成素第1-165位氨基酸的重组EPO(在哺乳动物细胞中表达)含三个N-连接和一个O-连接寡糖链，每一寡糖链均含末端唾液酸残基。后者对于使EPO逃脱被肝脏脱唾液酸糖蛋白结合蛋白迅速从循环中清除而言是非常重要的。促红细胞生成素的氨基酸序列(以单字母密码表示)如下APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFY本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经修饰的分子，其具有人促红细胞生成素（ＥＰＯ）的生物活性，且当其在体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物活性但未经修饰的分子。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：FJ卡尔，G卡特，T琼斯，S威廉斯，
申请(专利权)人：默克专利有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]