前列腺素E合酶2基因的破环制造技术

本发明专利技术涉及含有被破坏的前列腺素Ｅ合酶２基因遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞，以及治疗炎症介导疾病的方法，包括给予抑制前列腺素Ｅ合酶２的药剂。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及含被破坏的前列腺素E合酶2基因的遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞，以及治疗炎症介导疾病的方法，包括给予抑制前列腺素E合酶2的药剂。
技术介绍
前列腺素E2(PGE2)是通过PGH2降解或通过前列腺素E合酶(PEGS)催化反应衍生于前列腺素H2(PGH2)的一种重要的前列腺素类激素(Jakobsen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 967220-25，1999)。由环加氧酶(COX)-1或COX-2催化反应形成的PGH2用作所有前列腺素类激素产物形成的前体，所述产物包括前列腺素、前列腺环素和血栓烷(Smith和Marnett，Biochim.Biophys.Acta 10831-17，1991；Vane和Botting，Inflamm.Res.441-10，1995；Herschman，Biochim.Biophys.Acta 1299125-40，1996)。对PGE2的特异性单克隆抗体的研究显示PGE2是参于炎症的重要前列腺素类激素(Portanova等，J.Exp.Med.184883-91，1996)。注射PGE2通过血管扩张及血浆外渗和伤害感受器致敏而引起炎症(Vane和Botting，Inflamm.Res.47(Suppl.2)S78，1997)。而且，PGE2刺激基质金属蛋白酶的产生(Mehindate et al.，J.Immunol.1553570，1995)，刺激血管生成(Ben-Av等，FEBS Lett.37283，1995)和抑制T淋巴细胞调亡(Goetzl等，J.Immunol.1541041，1995)。一种形式的PGES(PGES1或cPGES)在多种哺乳动物细胞系中组成型表达并且细菌脂多糖(LPS)刺激后通常不变(Tanio双敲除等，J.Biol.Chem.4232775，2000)。可诱导形式的PGES(PGES2，iPGES，或mPGES-1)位于微粒体区室。需要注意的是mPGES-1已经成为PGES2的选择命名。PGES2酶已经鉴定为参与类花生酸和谷胱苷肽代谢的膜结合蛋白成员，且受白介素(IL)-1β诱导(Jakobsen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 967220，1999；Thoren和Ja双敲除bsen，Eur.J.Biochem.2676428，2000)。该酶最初被称为微粒体谷胱苷肽S转移酶1样1(Jakobsen et al.，Protein Sci.8689，1999)。各种研究已经表明COX-2和PGES 2以协调形式调节，并且提示PEGS2是涉及炎症、发热效应和细胞生长调节相关的COX-2介导反应中PGE2形成的关键酶(Yamagata等，J.Neuroscience 212669-77，2001；Murakami等，J.Biol.Chem.27532783-92，2000)。因此，提示抑制PGES2的药剂可提供作为可替换的或另外的COX-2抑制剂的治疗(Stichtenoth等，J.Immunol.167469-74，2001)。然而，PGES2抑制的完全作用仍待解析。因此需要另外的研究工具，包括PGES2敲除小鼠和PGES2敲除的ES细胞，以进一步确定PGES2在炎症反应中的作用和调节PGES2活性相关的治疗意义。专利技术概述本专利技术涉及PGES2基因被破坏的纯合或杂合的遗传修饰的非人哺乳动物和动物细胞。在第一个方面，本专利技术涉及遗传修饰的非人哺乳动物，其中该修饰导致PGES2基因被破坏。优选，哺乳动物是啮齿动物，更优选小鼠和/或该哺乳动物表现对实验诱导炎症模型的反应减弱，如减轻关节炎症，降低白细胞浸润，减少关节接合表面蛋白聚糖损失，和/或减轻炎症疼痛检测。在另一个优选实施方案中，该哺乳动物进一步包括被破坏的ApoE基因。本专利技术的第二个方面涉及遗传修饰的动物细胞，其中该修饰包括被破坏的PGES2基因。在优选实施方案中，该细胞是胚胎干细胞(ES)，ES样细胞或ES细胞衍生的巨噬细胞，该细胞在补充PGE2的培养基中培养，和/或该细胞是小鼠或人的。在另一个优选实施方案中，该细胞表现在炎症情况下PGE2产生降低。在另一个优选实施方案中，该细胞分离自含有导致PGES2基因被破坏的修饰的遗传修饰非人哺乳动物。在第三个方面，本专利技术涉及鉴定基因的方法，该基因表现表达改变，是由于在动物细胞中PGES2活性改变，所述方法包括比较遗传修饰的动物细胞与野生型细胞的表达情况，其中遗传修饰的动物细胞是PGES 2基因被破坏的遗传修饰的纯合细胞。本专利技术的第四个方面涉及治疗炎症介导疾病的方法，包括给予抑制前列腺素E合酶2的药剂。这种炎症包括慢性炎症(如，类风湿性关节炎和Th1介导疾病如多发性硬化症)，和急性炎症疼痛(如外伤介导的疼痛)。优选，该药剂以足以减轻关节炎症、白细胞浸润、在关节接合表面蛋白聚糖损失，和/或炎症疼痛检测的量给予。本领域技术人员将完全理解说明书和所附权利要求中描述本专利技术所使用的术语。然而，除非在此另外提出，下列术语如下面所述。“遗传修饰”的非人哺乳动物或动物细胞是修饰的杂合或纯合细胞，通过基因工程修饰被导入非人哺乳动物或动物细胞，或者导入祖先非人哺乳动物或动物细胞。可用于导入修饰的基因工程的标准方法包括同源重组、病毒载体基因捕获、放射、化学诱变和编码反义RNA单独或联合催化核酶的核苷酸序列的转基因表达。破坏基因的遗传修饰的优选方法是通过将“外来核酸序列”插入基因位点的修饰内源性基因的方法，如同源重组或病毒载体基因捕获。“外来核酸序列”是基因中非天然存在的外源序列。外来基因的插入可以发生在PGES2基因的任何区域，如增强子、启动子、调节区、非编码区、编码区、内含子或外显子。基因破坏的基因工程最优选方法是同源重组，其中外来核酸序列以定向方式单独插入或同时缺失部分内源基因序列。被“破坏”的PGES2基因是指经遗传修饰使得被破坏的基因所编码的PGES2多肽在正常表达野生型PGES2基因的细胞中的细胞活性降低或消失的PGES2基因。当遗传修饰有效消除了细胞中PGES2基因的所有野生型拷贝时(如遗传修饰、非人哺乳动物或动物细胞对PGES2基因破坏是纯合的或起初仅存在的PGES2基因的野生型拷贝现在被破坏)，遗传修饰导致PGES2多肽与表达野生型PGES2基因的对照细胞相比活性降低。PGES2多肽活性降低是PGES2基因表达降低(即PGES2 mRNA水平有效降低导致PGES2多肽水平降低)的结果和/或因为被破坏的PGES2基因编码与野生型PGES2多肽相比功能或稳定性改变如降低的突变多肽。优选，PGES2多肽在遗传修饰的非人哺乳动物或动物细胞中的活性降低至野生型水平的50％或更低，更优选至25％或更低，和甚至更优选至野生型水平的10％或更低。最优选，PGES2基因破坏引起已知方法检测不到的PGES2活性。含PGES2基因破坏的“遗传修饰的非人哺乳动物”是指例如通过产生携带目的遗传修饰的胚泡或胚胎，然后植入代孕母亲体内进行子宫发育而初次产生的非人哺乳动物。在小鼠的例子中，可以通过将遗传修饰的胚胎干细胞(ES)植入小鼠胚泡或通过聚集含四倍体胚泡的ES细胞来制备遗传修饰的胚泡或胚胎。在另一个方法中，使用ES细胞和桑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种遗传修饰的非人哺乳动物，其中该修饰导致破坏的ＰＧＥＳ２基因。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：LP奥德利，JE汉伯，ML罗奇，JL斯托克，OL弗兰克尼，M哈吉帕森德，
申请(专利权)人：辉瑞产品公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]