血浆游离核酸提取试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了血浆游离核酸提取试剂盒及其应用，其中，该试剂盒包括：(1)磁珠裂解结合液，(2)第一清洗液，(3)第二清洗液，(4)洗脱液。利用本发明专利技术的血浆游离核酸提取试剂盒能够快速提取血浆中的游离脱氧核糖核酸，且其使用快速简便，无需离心只需半小时就可以完成一次批量提取，且获得的核酸质量好，用于后续测序和检测的结果准确可靠，完全适用于现在的无创产前基因检测技术，在科学研究和临床检测方面都有重要的意义。

Plasma free nucleic acid extraction kit and its application

The invention discloses a plasma free nucleic acid extraction kit and its application, wherein the kit comprises: (1) a magnetic bead cracking binding liquid; (2) the first cleaning solution, (3) second cleaning fluid, and (4) eluent. The extraction kit can quickly extract in plasma free DNA using plasma free nucleic acid of the invention, and the use is convenient and fast without centrifugation only half an hour to complete a batch extraction, and obtained good quality nucleic acid, for subsequent sequencing and detection results are accurate and reliable, fully applicable to noninvasive prenatal genetic testing technologies, is of great significance in scientific research and clinical detection.

【技术实现步骤摘要】
血浆游离核酸提取试剂盒及其应用
本专利技术涉及血浆游离核酸提取试剂盒及其应用。
技术介绍
目前现有的传统核酸提取技术中所包含的沉淀和离心等操作需要用到大量的生物样本，而且传统提取技术步骤较为繁杂，费时长，收率低，很难实现自动化操作，大部分方法还需要操作人员直接接触有毒的化学试剂，因此，随着分子生物学以及高分子材料学的快速发展，传统的从液相系统中分离提取核酸的方式逐渐被以固相吸附物载体为基础的新方法所取代。这类新兴的核酸分离提取方法主要包括：旋转离心柱提取法、玻璃粉吸附法、二氧化硅基质法、阴离子交换法、纳米磁珠提取法等。目前离心柱法提取核酸应用得很普及，市场上的多数质粒DNA提取试剂盒都是在离心柱法的基础上发展而来的。该方法采用特殊的硅基质吸附材料，特点是：高盐酸性缓冲液存在时可特异性吸附DNA，除去RNA与蛋白质等不能结合的杂质，而低盐碱性缓冲液可洗脱结合在吸附柱上的DNA，然而这种方法的缺点是样本需求量大，耗费样品较多，对于某些珍稀样本其应用受到很大的局限，同时离心柱法提取核酸需要反复离心，不便于高通量、自动化操作，特别是在基因诊断、突发疫情的监测和控制等领域，另外使用离心柱法提取核酸需要大量的操作人员及仪器设备才能满足需求。因而，目前的核酸提取尤其是血浆游离核酸的提取方法仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种高效、低成本的血浆游离核酸的提取手段。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列研究和发现才完成的：目前新兴的核酸分离提取方法例如旋转离心柱提取法、玻璃粉吸附法、二氧化硅基质法、阴离子交换法，纳米磁珠法等，不管是采用具体的哪种方法来分离和提取核酸，总的来说，这类方法的大致原理主要可以分为三个步骤，第一步是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来。第二步是把释放的核酸特异地吸附在特定的载体上，并且这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力，而对其他的生化组分如蛋白质、多糖、脂类不能具有亲和力和吸附力。第三步是把吸附在特定载体上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸。由于离心柱法存在的种种不足，为了适应现代分子生物学检测实验高通量、高灵敏度、自动化操作的需要，运用磁珠提取核酸的方法应运而生了。磁珠法提取核酸的重大改进在于使用了一种由无机磁性粒子与高分子材料结合形成的高亲和力的复合磁性微球，由于其自身兼具高分子微球和磁性粒子的众多特性，故在没有外加磁场的情况下在溶液中分散均匀、稳定，而一旦增加了外加磁场则可简单快速地分离。该方法是纳米科技与生物技术的完美结合，具有其他核酸提取方法无法比拟的优势，主要体现在：(1)能够实现高通量操作和自动化，目前已有96孔的核酸自动提取仪，用一个样品的提取时间即可实现对96个样品的处理，效率直接提高96倍，符合生物学高通量的操作要求，使得传染性疾病暴发时能得到快速及时有效的应对；(2)操作简单、用时短，整个提取流程只有短短几步，基本上可以在30—40min完成；(3)安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒溶剂，对实验操作人员的伤害少，符合现代以人为本，安全至上的理念；(4)磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大；(5)磁珠提取核酸的方法采用智能化软件操作系统，既能控制孔间污染又能避免批次间的污染；同时保证实验结果的稳定性和重复性，避免人工操作引起的差异及错误；(6)成本低廉，便于广泛应用。由于磁珠合成采用的都是低价无机和有机原料，无须特殊的仪器设备，使得最终的合成和研发成本都很低，符合我国的基本国情和经济现状，便于广泛应用。利用磁珠法提取核酸除了磁珠外还需搭配一套核酸提取试剂，成功的核酸分离纯化需要四个重要的步骤：组织或细胞的破碎和裂解，核蛋白复合体的变性，核酸酶的灭活以及污染物的去除。理想的抽提方法可以获取高质量的靶核酸，同时没有蛋白，糖，脂和其它核酸污染。现代传统的核酸抽提方法主要包括盐酸胍，酚-氯仿抽提法，碱抽提法，溴化十六烷基三甲铵(CTAB)抽提法，溴化乙锭一氯化铯(EtBr-CsCI)梯度离心法和寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸(Oligo(dT))-纤维素层析法等。现代主要常用核酸提取的试剂包括：盐酸胍，异硫氰酸胍，十二烷基肌氨酸钠，十二烷基硫酸钠，十六烷基三甲基溴乙胺，EDTA，蛋白酶K，柠檬酸钠，Tris-HCl，异丙醇，70％乙醇，聚乙二醇PEG等，以下介绍其中重要化合物所起到相关作用。盐酸胍：盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，可以使蛋白变性，强度一般，可以保护DNA完整流出。异硫氰酸胍：强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂，在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍，它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。含有强力的阴离子和阳离子基团，它们可以形成较强的氢键。在还原剂存在的情况下，异硫氰酸胍可以断裂氢键，而去垢剂，如SDS存在的情况下，可以破坏疏水作用。十二烷基肌氨酸钠：作用使蛋白质解体，变性。十二烷基硫酸钠(SDS)：阴离子去垢剂，高温(55-65℃)裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，形成SDS/蛋白质/多糖复合物，释放核酸，提高盐(KAc或NaAc)浓度并降低温度(冰浴)，使SDS/蛋白质/复合物转变为溶解度更小的钾盐酸形式，使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全、离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的DNA。操作简单，温和，可提取到高分子量的DNA。SDS能裂解细胞，使细胞中的蛋白质和核酸之间常借着静电引力或配位键结合，阴离子去污剂能够破坏这种价键，使染色体离析，蛋白变性，释放核酸。此外，SDS还有以下作用：(1)SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质的疏水部位；(2)SDS可引起蛋白质构象改变；(3)SDS是一种良好的解离剂，可使蛋白质溶解，变性；(4)形成SDS-蛋白质复合物，并使复合物带负电。乙二胺四乙酸(EDTA)：酶抑制剂，螯合二价金属，抑制金属依赖性的酶，螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制细胞中DNase的活性，该酶可降解DNA。EDTA是去垢剂，结合离子用，而它结合的部分离子是能够诱发或者促进RNA酶活性的，比如Ca2+。EDTA是一种二价离子熬合剂，能熬合Mg2+和Ca2+等二价阳离子,而多种RNA酶的活性是需要依赖二价阳离子的，所以EDTA能通过熬合二价阳离子来抑制RNA酶的活性，碱性条件下才能够溶解，要和NaOH粉末混合后，再加水，然后用NaOH水溶液调节pH。0.01M，DNase酶基本失活。蛋白酶K：切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽键，将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。蛋白酶K在较广的pH范围内均有活性(pH4-12.5)温度范围37-60度盐浓度3MGuHCl或4M尿素中均有活性，在一些去污剂：Tween20(5％)和SDS(1％)条件下也有活性。蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌物、尿，粪便等。蛋白酶K的一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血浆游离核酸提取试剂盒，其特征在于，包括：(1)磁珠裂解结合液，包括：100mM‑1M pH 8.1‑8.4的Tris‑HCl缓冲液；10mM‑500mM的EDTA缓冲液；0.1％‑30％(w/v)的SDS缓冲液；0.1％‑10％(w/v)的柠檬酸钠缓冲液；1％‑50％(w/v)的聚乙二醇溶液；0.1‑10M的异硫氰酸胍溶液；以及余量的水，其中，在使用前，需向所述磁珠裂解结合液中添加10‑20％(w/v)的异丙醇，(2)第一清洗液，包括：0.1‑10M的异硫氰酸胍溶液；85mM‑1M pH 8.1‑8.4的Tris‑HCl缓冲液；10mM‑500mM的EDTA缓冲液；以及余量的水，其中，在使用前，需向所述第一清洗液中添加20‑30％(w/v)的无水乙醇，(3)第二清洗液，包括：1mM‑5M的Trizma Base缓冲液；1mM‑5M的NaCl溶液；至少0.04％(w/v)的NaN3溶液；以及余量的水，其中，在使用前，需向所述第二清洗液中添加1‑10倍体积的无水乙醇，(4)洗脱液，包括：1mM‑0.5M的Trizma Base缓冲液；1mM‑500mM的EDTA缓冲液；以及余量的水。

【技术特征摘要】
1.一种血浆游离核酸提取试剂盒，其特征在于，包括：(1)磁珠裂解结合液，包括：100mM-1MpH8.1-8.4的Tris-HCl缓冲液；10mM-500mM的EDTA缓冲液；0.1％-30％(w/v)的SDS缓冲液；0.1％-10％(w/v)的柠檬酸钠缓冲液；1％-50％(w/v)的聚乙二醇溶液；0.1-10M的异硫氰酸胍溶液；以及余量的水，其中，在使用前，需向所述磁珠裂解结合液中添加10-20％(w/v)的异丙醇，(2)第一清洗液，包括：0.1-10M的异硫氰酸胍溶液；85mM-1MpH8.1-8.4的Tris-HCl缓冲液；10mM-500mM的EDTA缓冲液；以及余量的水，其中，在使用前，需向所述第一清洗液中添加20-30％(w/v)的无水乙醇，(3)第二清洗液，包括：1mM-5M的TrizmaBase缓冲液；1mM-5M的NaCl溶液；至少0.04％(w/v)的NaN3溶液；以及余量的水，其中，在使用前，需向所述第二清洗液中添加1-10倍体积的无水乙醇，(4)洗脱液，包括：1mM-0.5M的TrizmaBase缓冲液；1mM-500mM的EDTA缓冲液；以及余量的水。2.根据权利要求1所述的血浆游离核酸提取试剂盒，其特征在于，在所述磁珠裂解结合液中，Tris-HCl缓冲液的浓度为120mM，任选地，在所述磁珠裂解结合液中，EDTA缓冲液的浓度为118mM，任选地，在所述磁珠裂解结合液中，SDS缓冲液的浓度为8.2％(w/v)，任选地，在所述磁珠裂解结合液中，柠檬酸钠缓冲液的浓度为2.5％(w/v)，任选地，在所述磁珠裂解结合液中，聚乙二醇溶液的浓度为5％(w/v)，任选地，在所述磁珠裂解结合液中，异硫氰酸胍溶液的浓度为4.2M。3.根据权利要求1所述的血浆游离核酸提取试剂盒，其特征在于，在所述第一清洗液中，异硫氰酸胍溶液的浓度为6M，任选地，在所述第一清洗液中，Tris-HCl缓冲液的浓度为94mM，任选地，在所述第一清洗液中，EDTA缓冲液的浓度为52mM。4.根据权利要求1所述的血浆游离核酸提取试剂盒，其特征在于，在所述第二清洗液中，TrizmaBase缓冲液的浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：萧哲，吴宗泽，蔡贤杵，徐快，黄健，申丹，赵振东，刘娜，
申请(专利权)人：深圳华大基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44