一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA的方法。本发明专利技术提供了一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA的方法，包括如下步骤：1)将动物肠道内容物或粪便经过差速离心；2)将所述微生物细胞结合使用液氮反复冻融裂解法、玻璃珠研磨法和裂解液高温裂解法进行细胞破碎，得到破碎后细胞；3)先提取所述破碎后细胞的基因组DNA，再纯化所述基因组DNA。本发明专利技术添加了微生物细胞的洗涤和富集步骤，降低了宿主和食物DNA的污染；组合多种微生物细胞裂解破碎的方法，降低宏基因组DNA的物种偏好性；增加纯化的步骤，保证DNA的纯度，可以满足构建第二代高通量测序文库的DNA要求。

A method for extracting microgenomic DNA from intestinal contents

The present invention discloses a method for extracting microgenomic DNA from intestinal contents. The present invention provides a method for extracting microbial metagenomic DNA from the intestinal contents, which comprises the following steps: 1) the animal intestinal contents or feces by differential centrifugation; 2) combining the microbial cells using liquid nitrogen freeze-thaw lysis method, glass bead method and pyrolysis of lysate cell broken, broken cells; 3) to extract the genomic DNA of broken cells, then the purified genomic DNA. The invention adds microbial cell washing and enrichment steps, reduce the host and food DNA pollution; microbial cell lysis method combined with many broken, species preference decreased metagenomic DNA; increase the purification steps, to ensure the purity of DNA, can meet the construction of the second generation high-throughput sequencing library DNA requirements.

【技术实现步骤摘要】
一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA的方法
本专利技术涉及宏基因组学领域，具体地说是一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA的方法，所获得的宏基因组DNA满足构建第二代高通量测序文库的要求。
技术介绍
宏基因组是生物环境中全部微生物的遗传物质的总和，即微生物群体的基因组，目前主要指细菌、古细菌和真菌的基因组总和。宏基因组学以微生物群体基因组为研究对象，研究微生物的遗传物质组成及微生物群落功能。近年来，随着高通量测序技术的发展和测序成本的降低，宏基因组测序技术已经逐渐渗透到诸多领域，人们对微生物菌群获得了全新认识，这些认识是依靠传统微生物培养方法无法获取的。微生物菌群宏基因组学的研究为医疗健康、环境能源和畜牧业等领域提供了重要的研究资源。人和动物的体表和体内存在数量巨大且种类繁多的微生物，与健康关系密切。目前已知不同部位的微生物数量相差很大，据估算人体皮肤表面的微生物约为<107/cm2,唾液约为109/mL，胃和小肠上段(十二指肠和空肠)的微生物约为103-104/mL,小肠下段(回肠)约为108/mL，大肠(结肠)约为1011/mL。人体大部分的微生物是肠道微生物，甚至约90％的微生物都集中在结肠内。人体肠道排出的每克粪便含有约1千亿个细菌，粪便干重约三分之一为细菌。肠道微生物如今已成为人类和动物健康的研究热点，研究表明，肠道微生物能影响宿主的营养吸收和免疫功能等，与多种疾病密切相关，例如肥胖、糖尿病、炎症性肠病等。由于取样和DNA提取的方便性，新鲜的粪便样品是目前肠道微生物宏基因组研究的主要样品。然而排出的粪便样品与体内肠道微生物有差异，尤其与胃和小肠部分(十二指肠、空肠、回肠)的微生物在数量和种类上都存在较大差异，因此，以粪便为对象的肠道微生物宏基因组学研究所能得到的结论具有局限性，不能真实体现体内肠道微生物的组成和功能，尤其不能反映胃和小肠内的微生物的真实情况。考虑到肠道是动物消化吸收的主要场所并且含有重要的免疫系统，随着肠道微生物宏基因组学研究的发展，人体的肠道内容物样品(例如胃肠道疾病手术时获取的样品)或者养殖动物的肠道内容物样品等，必定将越来越多地作为肠道微生物宏基因组学的研究对象，从而更深入地揭示微生物与宿主健康的关系。动物的肠道环境及其所含微生物具有复杂性，导致在微生物基因组DNA提取和纯化时面临着问题，需要开发适合肠道内容物的宏基因组DNA提取的完整流程方法，确保DNA能够成功提取并且真实准确地反应肠道微生物的种类和丰度。目前商用的相关提取试剂盒均仅针对粪便样品而设计。相比于粪便样品，小肠内容物的样品有如下特点：(1)微生物含量少，相同体积样品的微生物数量仅为粪便样品的0.1％-1％甚至更少；(2)小肠内容物中包含大量未消化的食物颗粒和碎片，这将影响微生物DNA的提取，导致食物DNA污染；(3)小肠上皮细胞更新速度快，成熟的上皮细胞最终在绒毛顶端凋亡和脱落，采集样品时机械外力也容易导致小肠绒毛损伤和细胞脱落，肠道内容物样品中存在宿主细胞和宿主DNA碎片，导致宿主DNA污染；(4)肠道内容物中有小肠消化液和多种杂质，容易引起DNA的降解或者容易抑制后续分子实验酶的反应活性。综上所述，直接使用粪便样品试剂盒的方法处理肠道内容物样品，尤其是小肠段的内容物样品，难以成功获得高质量的宏基因组的DNA。商用粪便样品DNA提取试剂盒已经针对粪便样品的特点进行了优化和改进，然而对于一些特殊的样品，杂质仍然残留并且影响下游的分子实验。在较早的研究中，提取的微生物群落的总DNA往往仅用于PCR实验，而PCR反应中所需的DNA仅作为扩增模板使用量很少，因此即使DNA的提取量很少或者残留部分杂质，还是能满足实验要求。但是对于高通量测序实验，宏基因组DNA的总量、纯度和完整性都必须满足更高的要求。另外，从成本上考虑，试剂盒的购买成本较高，显著增加了大量样本的宏基因组学研究的实验成本。除上述问题外，商用的粪便样品试剂盒还存在细胞裂解破碎效率的问题，各种商用试剂盒所采取的微生物细胞的裂解破碎方法不同，难以保证相同的裂解效率，裂解破碎步骤的偏好性会导致最终获得的微生物种类和丰度信息有很大差异。试剂盒普遍采用的裂解原理包括表面活性剂在高温下进行的化学法裂解，在溶菌酶等生物酶的作用下进行的生物法裂解，以及玻璃珠剧烈震荡下的物理法裂解。比微生物纯菌种的基因组DNA提取要求更高的是，宏基因组提取要求尽量完整地破碎所有种类的微生物，即是说要尽量避免不同微生物物种的裂解破碎效率的偏好性，尤其对于难以破壁的微生物依然要有高效率，最终才能真实地反映环境微生物的组成。试剂盒往往采用的方法往往都存在裂解的偏好性，不能得到真实的物种丰度问题。
技术实现思路
本专利技术一个目的是提供一种从动物肠道内容物或粪便中提取微生物宏基因组DNA的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：1)将动物肠道内容物或粪便经过差速离心，实现洗涤和富集微生物细胞；2)将所述微生物细胞结合使用液氮反复冻融裂解法、玻璃珠研磨法和裂解液高温裂解法进行细胞破碎，得到破碎后细胞；3)先提取所述破碎后细胞的基因组DNA，再纯化所述基因组DNA，实现从动物肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA。上述方法中，所述差速离心包括如下步骤：1)-1、将动物肠道内容物或粪便与含有Tween80的生理盐水混匀，低速离心，收集上清液，即得到含有微生物细胞的上清液；1)-2、将所述含有微生物细胞的上清液高速离心，收集沉淀，即得到微生物细胞。以上步骤中，在食糜沉淀多次加入生理盐水(含0.1％Tween80)震荡混合并且低速离心，能够将样品中全部的微生物细胞回收更完全，尤其是附着在食糜颗粒表面的微生物细胞；多次加入生理盐水(含0.1％Tween80)重悬洗涤微生物细胞再高速离心富集，能够将细胞样品洗涤更干净，尤其是附着在细胞表面或周围的杂质等。上述方法中，所述1)-1为如下：先将动物肠道内容物或粪便与含有Tween80的生理盐水混匀，低速离心，收集上清液和沉淀；再将所述沉淀与所述含有Tween80的生理盐水混匀，多次低速离心，且每次低速离心的样品为向上一次低速离心沉淀添加所述含有Tween80的生理盐水得到的混合物；合并所有低速离心获得的上清液，得到含有微生物细胞的上清液；所述1)-2为如下：将所述含有微生物细胞的上清液高速离心，收集沉淀；再将所述沉淀与所述含有Tween80的生理盐水混匀，多次高速离心，且每次高速离心的样品为向上一次高速离心沉淀添加所述含有Tween80的生理盐水得到的混合物；收集最后一次高速离心沉淀，得到微生物细胞。上述方法中，所述含有Tween80的生理盐水中Tween80的质量体积百分含量为0.1％；或，所述多次低速离心的次数为2-4次；或，所述低速离心的条件为0-4℃、200-300g离心10-20min；或，所述多次高速离心的次数为2-3次；或，所述高速离心的条件为0-4℃、17000-21000g离心10-20min。上述方法中，所述结合使用液氮反复冻融裂解法、玻璃珠研磨法和裂解液高温裂解法为将所述微生物细胞依次经液氮反复冻融裂解法、玻璃珠研磨法和裂解液高温裂解法进行破碎。上述方法中，所述液氮反复冻融裂解法为将所述微生物细胞在液氮中5-15mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从动物肠道内容物或粪便中提取微生物宏基因组DNA的方法，包括如下步骤：1)将动物肠道内容物或粪便经过差速离心，实现洗涤和富集微生物细胞；2)将所述微生物细胞结合使用液氮反复冻融裂解法、玻璃珠研磨法和裂解液高温裂解法进行细胞破碎，得到破碎后细胞；3)先提取所述破碎后细胞的基因组DNA，再纯化所述基因组DNA，实现从动物肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA。

【技术特征摘要】
1.一种从动物肠道内容物或粪便中提取微生物宏基因组DNA的方法，包括如下步骤：1)将动物肠道内容物或粪便经过差速离心，实现洗涤和富集微生物细胞；2)将所述微生物细胞结合使用液氮反复冻融裂解法、玻璃珠研磨法和裂解液高温裂解法进行细胞破碎，得到破碎后细胞；3)先提取所述破碎后细胞的基因组DNA，再纯化所述基因组DNA，实现从动物肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述差速离心包括如下步骤：1)-1、将动物肠道内容物或粪便与含有Tween80的生理盐水混匀，低速离心，收集上清液，即得到含有微生物细胞的上清液；1)-2、将所述含有微生物细胞的上清液高速离心，收集沉淀，即得到微生物细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述1)-1为如下：先将动物肠道内容物或粪便与含有Tween80的生理盐水混匀，低速离心，收集上清液和沉淀；再将所述沉淀与所述含有Tween80的生理盐水混匀，多次低速离心，且每次低速离心的样品为向上一次低速离心沉淀添加所述含有Tween80的生理盐水得到的混合物；合并所有低速离心获得的上清液，得到含有微生物细胞的上清液；所述1)-2为如下：将所述含有微生物细胞的上清液高速离心，收集沉淀；再将所述沉淀与所述含有Tween80的生理盐水混匀，多次高速离心，且每次高速离心的样品为向上一次高速离心沉淀添加所述含有Tween80的生理盐水得到的混合物；收集最后一次高速离心沉淀，得到微生物细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述含有Tween80的生理盐水中Tween80的质量体积百分含量为0.1％；或，所述多次低速离心的次数为2-4次；或，所述低速离心的条件为0-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳，江帆，樊伟，刘博，李书曲，王恒超，刘聪辉，任钰为，尹丽娟，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业基因组研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44