【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因组测序，特别涉及一种用于微量细胞的靶向染色质互作捕获uli-ehichip建库方法及应用。
技术介绍
1、基因表达受多种因素调控，其中组蛋白修饰和转录因子对基因表达调控起到重要的作用mesc 0.1 million (10万)(陈桂芳等, 2021, 生物技术通报)。解析组蛋白修饰和转录因子对基因表达调控的机理，有助于对生物体在疾病产生原理、生长发育表观遗传性状等方面有清楚的认识。染色质免疫共沉淀测序(chip-seq)是一种是利用染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation, chip)特异性地富集目的蛋白结合的dna片段，再对其进行测序的技术。chip-seq可以绘制特定蛋白因子与基因组结合的一维景观图。然而其不能提供理解染色质3d特征(比如，染色质互作)，当前相关方法很少。自染色体构象捕获技术出现以来，在全基因组范围内探测染色质长程相互作用的方法取得了巨大的发展，主要有全基因组染色质构象捕获测序技术（hi-c）及其衍生技术及方法。hi-c技术试图捕获全基因组范围内所有的近端和远端相互作用。但仍然存在分辨率低、特异互作抓取不全面的局限性。为了满足分辨率要求，需要高深度测序来较为完整的识别染色质的结构特征(mumbach mr et al, 2016, nature methods)。chia-pet，plac-seq和hichip等技术的出现，丰富了特定蛋白因子介导的染色质相互作用(zelenka t et al, 2021, methods andprotocols)。
2、目前hichip所需细胞量仍然较高（一般需要10万+细胞数量，当细胞数量低于10万时，则没法制备相应的文库），基于该技术局限，因此亟需开发一种高效的、基于微量细胞数起始量级别的hichip测序技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种新的用于微量细胞的靶向染色质互作捕获uli-ehichip建库方法及应用，以解决上述问题。
2、根据本专利技术的第一个方面，提供了一种用于微量细胞的靶向染色质互作捕获uli-ehichip建库方法，其中，所述微量细胞是指细胞数低于100000个，该方法包括如下步骤：
3、s1：对目标细胞进行收集；
4、s2：然后将甲醛加至装有收集的细胞的培养皿中进行甲醛交联；
5、s3：对甲醛交联固定染色质后的细胞进行裂解，采用含有1% pi和0.2% igepalca630的透化缓冲液来进行细胞的透化裂解；
6、s4：对透化裂解的细胞采用限制性双内切酶组合进行双酶切，所述限制性双内切酶组合为dpnii与hpych4iv、mboi 与 hpych4iv、sau3ai与hpych4iv三种组合中的任意一组；
7、s5：将步骤s4中酶切后的产物进行re-qc质控：所述re-qc质控方法为将酶切后产物进行电泳检测，电泳条带在100-12000 bp呈弥散状，且12kb无条带，为质控合格；
8、s6：在酶切质控合格后，对酶切后的dna片段进行末端生物素标记，然后进行邻位连接及超声打断后，得到游离的单分子状态的蛋白因子-dna互作小体；
9、s7：将步骤s6中蛋白因子-dna互作小体经抗体免疫沉淀、protein a 磁珠捕获、润洗后，得到捕获有染色质互作小体的抗体沉淀磁珠；
10、s8：将步骤s7中捕获染色质抗体沉淀dna的磁珠经溶解、柱纯化后，得到纯化的染色质抗体沉淀dna；
11、s9：将步骤s8中纯化的dna用免疫磁珠抓取生物素标记的互作dna，用tn5转座酶一步建库法或fea enzym酶切片段化法制备uli-ehichip 文库：先将互作dna用tn5转座酶或fea enzym酶打断，打断后进行pcr扩增，对pcr产物进行e-gel胶电泳，最终进行切胶回收制备uli-ehichip文库，所述切胶回收的片段为150-1000 bp。
12、由此，通过本方法，可以实现微量细胞起始量的染色质互作捕获技术的uli-ehichip建库，细胞起始量最低可以100个细胞，远低于现有hichip技术对细胞样品起始量的要求（需要大于10万个细胞）。采用本方法制备文库时细胞需要量少，针对稀有细胞和微量医学检验细胞具有应用潜力，节约收集细胞材料难度和时间，降低细胞培养成本，同时微量的试验试剂操作体系，降低了细胞损失，节约了技术用试剂成本。
13、在某些实施方式中，该微量细胞是指细胞数量为100-100000个。由此，通过该方法可以实现微量细胞起始量的uli-ehichip建库，通过设计100、1000、10000、100000个细胞进行了验证，均可以获得质量良好的uli-ehichip文库。
14、在某些实施方式中，步骤s2中除了用甲醛进行单交联，还可以用甲醛和egs加至装有收集的细胞的培养皿中进行双交联。由此，可以大大提高交联效率和交联固定质量。
15、在某些实施方式中，上述方法的步骤s9中还包括将制备的uli-ehichip 文库再次进行e-gel胶电泳及切胶回收，制备纯净的uli-ehichip 文库。由此，通过将含有不同“条形码”接头的初始文库混合为大文库后再次按一致大小范围切胶纯化，可以得到无接头污染的纯净文库，以此可以大大降低文库的接头污染，提高数据产出。
16、在某些实施方式中，上述方法的步骤s6中，对酶切后的dna片段进行末端生物素标记时是采用混有生物素标记的碱基试剂fill-in master mix，该fill-in master mix使用量为100-100000个细胞用量4.7μl。而现有技术中，fill-in master mix使用量为50μl，由此可以大大降低生物素的使用，不仅节约成本，也降低了后续洗脱、回收纯化的难度。
17、在某些实施方式中，上述方法的步骤s7中，蛋白a磁珠使用量为10μl，而在现有技术中每10 million细胞需要使用60μl蛋白a磁珠。由此，减少了蛋白a磁珠的使用量一方面可以减少检测试剂成本，另外一方面也可以优化建库步骤，提高建库效率。
18、在某些实施方式中，上述方法的步骤s6中，邻位连接采用的连接反应液包括nebt4 dna ligase buffer，triton x-100，重组白蛋白recombinant albumin，t4 dna ligase和水。由此，用重组白蛋白recombinant albumin代替传统技术中的bsa，可以提高连接效率。
【技术保护点】
1.用于微量细胞的靶向染色质互作捕获ULI-eHiChIP建库方法，其中，所述微量细胞是指细胞数低于100000个，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微量细胞是指细胞数量为100-100000个；所述步骤S2中除了用甲醛进行单交联，还可以用甲醛和EGS加至装有收集的细胞的培养皿中进行双交联。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤S9中还包括将制备的ULI-eHiChIP文库再次进行E-gel胶电泳及切胶回收，制备无接头污染的ULI-eHiChIP文库。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤S6中，所述对酶切后的DNA片段进行末端生物素标记时是采用混有生物素标记的碱基试剂Fill-in Master Mix，所述Fill-inMaster Mix使用量为4.7μL；所述步骤S7中，所述蛋白A磁珠使用量为10μL。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤S6中，所述邻位连接采用的连接反应液包括NEB T4 DNA ligase buffer，Triton X-100，重组白蛋白Rec
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤S6中还包括将生物素标记及邻位连接后的蛋白因子-DNA互作小体进一步用Lambda Exonuclease、RecJf核酸外切酶进行背景消除，经处理后再进行超声打断及后续操作。
7.权利要求1-6任一项所述的方法在微量细胞起始量的细胞ULI-eHiChIP文库构建上的应用，其中，所述微量细胞起始量为100-100000个。
8.采用权利要求1-6任一项所述的方法制备的微量细胞ULI-eHiChIP文库。
9.权利要求8中所述的ULI-eHiChIP文库在微量细胞高通量测序中的应用。
10.权利要求8中所述的ULI-eHiChIP文库在针对微量细胞的三维基因组学或功能基因组学研究中的应用。
...【技术特征摘要】
1.用于微量细胞的靶向染色质互作捕获uli-ehichip建库方法，其中，所述微量细胞是指细胞数低于100000个，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微量细胞是指细胞数量为100-100000个；所述步骤s2中除了用甲醛进行单交联，还可以用甲醛和egs加至装有收集的细胞的培养皿中进行双交联。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤s9中还包括将制备的uli-ehichip文库再次进行e-gel胶电泳及切胶回收，制备无接头污染的uli-ehichip文库。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤s6中，所述对酶切后的dna片段进行末端生物素标记时是采用混有生物素标记的碱基试剂fill-in master mix，所述fill-inmaster mix使用量为4.7μl；所述步骤s7中，所述蛋白a磁珠使用量为10μl。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤s6中，所述邻位连...
【专利技术属性】
技术研发人员：孔思远，田蕴涵，常荣荣，孔大帅，张玉波，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业基因组研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。