一种抑制基因表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种抑制细胞中靶基因表达的方法，包括将从目标基因中特定选择的序列用于设计能产生本发明专利技术小干涉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）的双链或其它形式ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ前体或ｓｉＲＮＡｐ），导入该ＲＮＡ，从而抑制细胞基因的表达。采用这种方法可以预防和治疗疾病，例如严重急性呼吸道综合症（ＳＡＲＳ）和人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）感染。该方法可以在体内或体外进行。虽然生产的小干涉ＲＮＡ通常为长２３个核苷酸或更短的序列，但是，本发明专利技术的从目标基因中选择序列的方法可适用于任何长度的双链ＲＮＡ。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用能产生小干扰RNA(siRNA)的双链核糖核酸(dsRNA)进行的基因特异性抑制。构建的dsRNA的数量和序列的选择依据本专利技术所阐述的标准。此外，选择的能产生siRNA的dsRNA的特定导入方法将可能解决目前在预防和治疗SARS和HIV感染中存在的困难。
技术介绍
近年来，RNA的干涉作用在生物学领域带来了很多惊喜。早在1990年，生物学家Rich Jorgensen在试图使紫色牵牛花变得更紫时，就首次观察到了这种干涉作用。他插入了另一拷贝的限速酶基因，但结果牵牛花不是变紫，反而变白了。他称这种反常作用为“共抑制”，但在当时，没有人知道为什么在加入了更多促使特定颜色显现的基因后反而会使该基因关闭。5年后，实验研究表明，使用单链的对照“有义”链RNA与“反义”链一样能抑制靶基因。1998年，Andrew Fire和Craig Mello通过证实双链RNA是真正的沉默物质而揭露了其中的奥秘。他们称之为“RNA干涉”，并由此诞生了一个新的领域(Blocker B.RNA interference dazzles researchcommunity.Journal of the National Cancer InstitueVol.95，No.7，April2，2003)。Tuschl小组将该技术延伸至哺乳动物细胞，并产生了RNA干涉或现称的RNAi(Elbashir S.M.，Harborth J.，Weber K.，Tuschl T.Analysis ofgent function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs.Academic PressMethods 26(2002)199-213)。在哺乳动物中，双链RNA或dsRNA主要是通过转录后机制靶向降解mRNA发生作用，同时已知这种序列特异性靶向识别的介质是由大约21个核苷酸组成的小干涉RNA(siRNA)。这些小的siRNA通常是由一种较长的dsRNA在天然状态下与Dicer RNA酶III发生反应产生，当这种siRNAs形成后，它们又与另一种称为RNA-诱导沉默复合体(RISC)结合。专利技术概要如上文所述，所述的RISC siRNA复合体还未明确定义。选择用作起始dsRNA或siRNAp模板的正确序列的工作目前还未标准化。实际上，可以有许多的序列组合都适合19-23个核苷酸(nt)dsRNA或siRNAp的标准，即使可能，决心从中选择出正确的一个序列仍将十分困难。为了试图构建更好的siRNAp或dsRNA，本专利技术将其与核糖核酸酶蛋白结合，该RISC蛋白最终使siRNA展开形成单链，这将引导RISC复合体使细胞质靶mRNA发生降解(Hannon GJ.RNA interference.NatureVol.418，July 11，2002)。在某些物种中，siRNA RISC复合体也可以通过染色质或其它能有效地改变基因遗传表达的位点插入到序列特异性DNA中。如果这些siRNA与其它相同或不同靶向的RNA互补，则能产生可转移RNAi。在一些有机体中，以靶mRNA为模板，RNA依赖或指导的RNA聚合酶(RdRP)也能启动siRNA的合成，然后通过非RISC的Dicer RNA裂解作用使靶mRNA失活。有时，即使在微量的dsRNA的引发下，siRNA使靶mRNA沉默的一些效果也能扩大并扩散至整个机体。然而，迄今为止，这种效果并没有在哺乳动物中观察到。来源于双链或其它前体的SiRNA复合体，目前被广泛地用于使培养细胞中的哺乳动物基因沉默。这些功能性siRNAs的导入和形成目前可以采用不同方法来实现，如转染，电穿孔，以及基于质粒和基于病毒的表达系统。迄今为止，将siRNAs直接导入动物局限于仅有的几例。当注射到动物的尾部静脉或脑纹状体区域时，在CMV启动子调控下表达siRNAs的重组腺病毒降低了小鼠肝脏或大脑中的靶基因表达。迄今为止，只有Lieberman实现了真正的疾病预防他们将相当于动物血液总体积一半的3倍高压注射液注射给小鼠，从而迫使siRNA指导Fas基因定向进入肝脏(Couzin J.RNAi to the liver’s rescueScience NOW-Couzin 2003(210)1)，大约有80％至90％的肝细胞整合了该RNA分子。第二天，给予动物一种抗体而使Fas过量，导致肝脏坏死。结果显示，绝大多数的对照组小鼠死亡，然而82％的受治疗小鼠存活。该动物研究的首次成功毫无疑问会引导进一步研究而将该项技术用于治疗人类疾病。定义靶基因中的上述序列。向某种疾病的普通的目的白细胞或者特别的淋巴细胞中导入siRNA也是困难的。在本专利技术中，向呼吸系统和体外干细胞中直接导入这些特别设计的siRNAs将有助于绕开治疗SARS和HIV病毒感染中存在的一些困难。专利技术的详细描述选择dsRNA或siRNAp正确序列的方法基于几种已知的标准从基因序列中选择候选目标区域。我们查找了转录起始位点下游的至少50bp，确定符合AA(n19)TT模式的区域，其中n可以为任何碱基。但是如果不存在这种模式，则选择其它的次优选序列(如nA(n19)Tn、nA(n19)nn)，它们必须具有大约50％的GC比率，且不含长串的核苷重复。虽然该选择得到一种21-nt的dsRNA寡核苷酸，但该项技术还可用于获得任何长度的寡核苷酸。然后针对能产生天然发夹结构或其它mRNA二级折叠的上游或下游同源区筛选这些siRNA候选区域(AA(n19)TT区域)。按3’-5’的方向阅读包含(表1)或不包含(表2)第一个和最后两个碱基的上述候选区域的5’端10个碱基或3’端的10个碱基，并确定位于同一mRNA上的任何这些区域的互补区域。基于下游碱基对的配对数量，对起始候选区域打分，并选出最互补同源序列(表1-3)。构建互补dsRNA寡核苷酸，使反义链互补于其19bp的中心区域。每一链都具有3’dTdT的突出，其全部或仅仅是其中的5’dT互补于靶序列(mRNA上外显子序列，人们试图对其序列翻译进行抑制)相应的5’端区域。对候选序列进行筛选并用相关的BLAST数据库(htttp//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行配对以系统地检测非特异性同源部分，排除那些同源性超过75％的序列。通过商业的寡核苷酸合成公司(Proligo)或其它可用的生产方式对siRNA寡核苷酸进行测序和合成。 表1以人端粒酶RNA(hTR)的23-nt区域为靶的潜在siRNA。除3’dTdT突出的配对碱基外，最终的区域基于19-nt识别序列。除其它标准外，最终siRNA的选择是基于同源配对数量。下游互补同系物从其碱基计数起点开始计数。 表2以人端粒酶反转录酶亚基基因(hTERT)为靶区域的潜在siRNA。仅在19nt内部识别序列的基础上选择区域。除其它标准外，最终siRNA的选择是基于同源配对数量。互补同系物从其碱基计数起点开始计数。 表3以SARS复制酶(pol)编码区的为靶区域的潜在siRNA。在21bp内部同源序列(每一突出端的第一个碱基)的基础上选择区域。除其它标准外本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制细胞中靶基因表达的方法，包括向细胞中导入能产生小干涉核糖核酸（ｓｉＲＮＡ）的ｄｓＲＮＡ或ｓｉＲＮＡ前体，其中ｄｓＲＮＡ或ｓｉＲＮＡ前体具有与靶基因的靶向被选择区域序列一致或接近一致的双链结构或单链发夹结构，该靶向被选择区域为在靶基因同一链中具有另一互补或接近互补区域而使该链形成双链的天然发夹结构或多种相同或不同发夹ｄｓＲＮＡ的区域。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨华显，
申请(专利权)人：杨华显，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]