本发明专利技术公开了一种根农杆菌介导转化黑麦草的方法，该方法包括以下步骤：１）以胚为外植体诱导愈伤组织；２）将愈伤组织浸泡于带有植物表达载体的根农杆菌菌液中；３）将菌液浸泡过的愈伤组织置于共培养培养基上共培养；４）将受体组织置于诱导筛选培养基上进行抗性愈伤组织的诱导；５）将生长的抗性愈伤组织置于分化培养基上使其分化出再生植株。本发明专利技术解决了长期以来人们一直期望解决的黑麦草转基因育种难的问题，为黑麦草的转基因育种搭建了一个可靠实用的平台，具有重要的理论及实践意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及转基因草坪草的生产方法，特别是涉及。
技术介绍
草坪草在改善生态环境，提高生活质量等方面起着重要的作用，具有显著的生态效益。但是由于草坪草存在耗水量大，不能耐受过冷或过热的气候，绿期较短等不足之处，限制了其更广泛的应用。现代分子生物学的迅猛发展，为草坪草新品种的培育提供了新的技术平台。目前，已知的转基因技术有外源基因直接导入法，如碳化硅纤维介导法，聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化法，基因枪法，电击转化法等；以及根农杆菌介导法。外源基因直接导入法不受物种和基因型的限制，但这种方法成本较高，同时，外源DNA多数情况下以多拷贝、前后串连重复的形式整合在基因组的随机位点，易引起转基因沉默以及在转基因后代中发生重排丢失等系列问题。相比之下，根农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的外源基因转化法，能将外源基因以低拷贝形式插入基因组转录活跃区，从而大大降低了基因重排和基因沉默的机率，使外源转化基因在受体植物中能稳定遗传，而且该方法成本较低。根农杆菌介导法最早应用于双子叶植物的转基因研究，1984年Horsch等建立了根农杆菌介导的叶盘法植物转化技术体系。随着人们对根农杆菌转化机理研究的不断深入，最近十年来利用根农杆菌成功转化单子叶植物的报道逐渐增多，如水稻(Hiei Y，Ohta S，Komari T，Kumashiro T.Efficient transformation of rice(Oryza sativaL.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of theT-DNA.Plant J 6271-282，1994)，玉米(Ishida Y，Saito H，Ohta S，Hiei Y，Komari T，Kumashiro T.High efficiency transformation of maize(Zeamays)mediated by Agrobacterium tumefaciens.Nat Biotechnol 4745-750，1996)，小麦(Cheng M，Fry J E，Pang S，Zhou H，Hironaka C M，Duncan D R，Conner T W，Wan Y.Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens.Plant Physiol 115971-980，1997)，大麦(Tingay S，McElroy D，Kalla R，FiegS，Wang M B，Thornton S，Brettell R.Agrobacterium tumefaciens-mediated barleytransformation.Plant J 111369-1376，1997；Trifonova A，Madsen S，OlesenA.Agrobacterium-mediated transgene delivery and integration into barleyunder a range of in vitro culture conditiohs.Plant Sci 162871-880，2001)，甘蔗(Arencibia A D，Carmona E R，Tellez P，Chan M T，Yu S M，Trujillo L E，Oramas P.An efficient protocol for sugarcane(Saccharum spp.L.)transformationmediated by Agrobacterium tumefaciens.Transgenic Res 7213-222，1998)及高粱(Zhao Z Y，Cai T，Tagliani L，Miller M，Wang N，Pang H，Rudert M，SchroederS，Hondred D，Seltzer J，Pierce D.Agrobacterium-mediated sorghumtransformation.Plant Mol Biol 44789-798，2000)等。这些研究表明，根农杆菌介导的转化多为单一位点插入，约三分之二的转基因植物外源基因的拷贝数小于3。目前，黑麦草转基因技术多数仍以悬浮培养细胞或原生质体作为转化的受体材料，采用直接导入法进行外源基因转化，这种方法的缺陷是受体材料的培养难度高和成本大，而且获得转基因植株的周期较长，频率较低。例如，Heleen M.van der Mass等用基因枪法得到了稳定转化gusA基因的多年生黑麦草非胚性悬浮培养细胞系(Heleen M.van der Mass，Eliza R.de Jong，Saskia Rueb，Lambert A.M.Hensgensand Frans A.Krens，Stable transformation and long-term expression of the gusAreporter gene in callus lines of perennial ryegrass(Lolium perenne L.).PlantMolecular Breeding，24401-405，1994)，其抗性愈伤组织的频率为总转化细胞的3.57×10-6，因该细胞系没有胚性，故未能获得转基因植株。1995年，Spangenberg G等报道了用基因枪法转化多年生黑麦草胚性悬浮培养细胞的方法(Spangenberg G，Wang ZY，Wu XL，Nagel J，Potrykus I，Transgenic perennial ryegrass(Loliumperenne)plants from microprojectil bombardment of embryogenic suspensioncells.Plant Sci.108209-217，1995)，应用该法共转化了96皿悬浮培养细胞(每皿有200-250mg悬浮培养细胞)，得到36块抗性愈伤，抗性愈伤的23％分化获得植株。1997年，Ye X.等也利用基因枪法成功转化了多花黑麦草胚性悬浮培养细胞(Ye X.，Wang Z Y，Wu X，Potrykus I.，Spangerberg G，Transgenic Italinryegrass(Lolium multiflorum)plants from microprojectil bombardment ofembryogenic suspension cells.Plant Cell Reports.16379-384.1997)，应用该法共转化了156皿悬浮培养细胞(每皿有200-250mg悬浮培养细胞)，得到93块抗性愈伤，抗性愈伤的33％分化成植株。根农杆菌介导法在植物的遗传转化技术中有其无法取代的优越性，但它受到受体植物的基因型和受体组织材料的状态等等因素的限制，因此该技术在一个新的受体植物上的建立和实施是非常困难的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种诱本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种根农杆菌介导转化黑麦草的方法，包括以下步骤：１）以胚为外植体诱导愈伤组织；愈伤组织诱导培养基是在ＭＳ基本培养基的基础上添加了２，４－二氯苯氧基乙酸和６－苄氨基嘌呤；２）将愈伤组织浸泡于带有植物表达载体的根农杆菌菌液中； ３）将菌液浸泡过的愈伤组织置于共培养培养基上共培养；共培养培养基是在ＭＳ基本培养基的基础上添加了２，４－二氯苯氧基乙酸和６－苄氨基嘌呤；４）将受体组织置于诱导筛选培养基上进行抗性愈伤组织的诱导；抗性愈伤组织诱导筛选培养基是在Ｍ Ｓ基本培养基的基础上添加了２，４－二氯苯氧基乙酸、６－苄氨基嘌呤和选择性抗生素；５）将生长的抗性愈伤组织置于分化培养基上使其分化出再生植株；分化培养基是在ＭＳ基本培养基的基础上添加了６－苄氨基嘌呤、激动素和选择性抗生素。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈蕾，陈宛新，王蕾，韩晶，陈依珏，
申请(专利权)人：北京北方杰士生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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