高通量哺乳动物细胞培养基优化方法技术

公开了一种细胞培养基优化的方法，该方法包括步骤：ａ．将细胞接种到多孔板中的不同成分的培养基中，所述培养基为至少２种；ｂ．在相同条件下培养这些细胞；ｃ．检测活细胞数；和ｄ．选择活细胞数最多的培养基作为优选培养基。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞培养、生物制药领域，更具体地涉及高通量哺乳动物细胞微培养以及活细胞浓度检测方法，用于细胞培养基成分优化。
技术介绍
重组DNA技术的发展已使蛋白质药物大规模生产、取代从生物原料提取成为可能；毫无疑问，随着人类基因组学和蛋白组学研究的开展，会有更多的基因功能得到鉴别，与之相应的将是会有更多的蛋白质药物出现并用于临床试验和疾病治疗。蛋白质药物的生物合成有若干途径可以选择，包括哺乳动物细胞培养、微生物发酵、转基因动物和转基因植物。就目前来讲，微生物发酵主要用于不需要修饰的蛋白质药物生产，而大规模动物细胞培养主要用于翻译后需要糖基化等修饰的蛋白质的生产。虽然转基因动物、植物在蛋白质药物生产方面有大幅度降低生产成本的可能，但技术研发过程复杂，技术市场取向目前尚不能同大规模动物细胞培养相比。另外，蛋白质修饰物种之间的差异也可以对影响药物的功能和免疫反应程度造成影响。哺乳动物细胞培养的商业化生产应用需要大量的过程研发工作奠定基础。过程研发的目的是在保证产物质量的前提下，即在保证药物性能的基础上，提高产率，降低生产成本，使实现商业利润成为可能。经过多年不断努力，大规模动物细胞培养工艺已经日趋成熟。搅拌式生物反应器目前是大规模细胞悬浮培养的首选设备，常用的操作模式有间歇和流加两种。就生产原料来说，无血清和无蛋白细胞培养基是目前大规模细胞培养的主要材料，可以摆脱昂贵的血清或蛋白质成份，避免外源生物污染(如病毒和疯牛病)、资源限制和原料生物活性不稳定性(批间差异)，提高过程稳定性和操作规范化程度，降低一般占总成本大部分的下游过程成本。细胞培养过程优化包括培养基成分优化、反应器操作条件优化和反应器操作模式选择等几部分，而针对具体生产过程配置并优化培养基成分是现代大规模细胞培养过程研究的主要任务之一，工作量非常大。一般来说，每一细胞株都有独特要求，没有任何一种培养基会充分满足所有细胞株的需要或发挥细胞的最大生产潜力。具体培养基成份的确定需要结合细胞生长、产物产率与质量、反应器类型和操作方式及物理环境等因素整体考虑。由于培养基成分十分复杂(含数十种生化成分)，细胞培养周期长，以往的方法如采用小型生物反应器或转瓶或摇床，培养数有限，不能在有限的时间内完成所需要的实验数量，而且分部执行又容易产生实验结果批间的不可比性，耗时、效率低、成本高。例如优化培养基成分假如培养基的化学成分有50种，每种化学成分只有2个浓度水平，如果每一个成分和每一个浓度水平搭配起来进行实验，那么所需要的培养数为250，即1.126×1015个培养，这是不可能实现的。即使采用正交实验方法，考虑到培养基组分的相互作用，实验量也在万次以上，采用常规方法也不可能完成。针对以上实际问题，本领域技术人员主要通过合理地设计实验，简化实验方案，降低工作量，另一方面则要依靠能模拟反应器环境、操作模式的高通量细胞培养系统，提高批次实验数量来实现培养基的筛选。刃天青，又称树脂天青、偶氮间苯四酚、树脂酚天青，英文名称Alamar Blue，Resazurin，Diazoresorcinol，Resazoin，分子式C12H7NO4，分子量229.2。由于其酚羟基在不同pH环境中解离程度不同而呈不同颜色，刃天青可用作酸碱指示剂，pH3.8(橙色)-6.5(深紫色)。刃天青经氧化还原反应，可被还原为试卤灵(Resorufin)。该反应也可以在刃天青被细胞吸收之后在细胞内完成。在真核细胞线粒体中，刃天青可以作为呼吸链电子最终受体，经酶催化，取代氧而被还原；在原核细胞中刃天青经酶催化还原的机理目前尚不清楚。由于刃天青和试卤灵在光吸收方面有较大区别，最大光吸收波长分别为573(试卤灵)和605nm(刃天青)，刃天青在605nm有最大光吸收，而试卤灵的光吸收接近于零，可应用于细胞代谢活性分析。另外，试卤灵具有荧光性质，该特性也可应用于细胞代谢活性分析，以及可以以此为指标的其它应用如化学和生化物质毒性、药物筛选等方面。美国专利5413916(Colorimetric toxicity test，1995年)采用大肠杆菌作为生物样本、戊二醛作为细胞膜电子供体，利用刃天青的氧化还原颜色反应，建立了一个颜色毒性检测方法，反应在试管中完成，并用分光光度计测量光吸收，波长为603nm。美国专利5501959(Antibiotic and cytotoxic drug susceptibility assaysusing resazurin and poising agents，1996年)针对刃天青在培养液中存在时间较长(如24小时)会发生自还原(Autoreduetion)现象，提出使用平衡剂(Poisingagent)并控制培养液氧还电位的方法(商品名Alamar Blue)，来降低自还原现象所引起的检测偏差。该专利用此方法结合荧光检测(激发光540-560nm，荧光580-600nm)用来检测细胞存活率，以此检测药物对肿瘤细胞的杀伤作用。美国专利6271022(Device for incubating and monitoring multiwell assays，2001年)专利技术了一种可以对细胞在多孔板中监测细胞生长的仪器，其检测手段为相机和扫描仪，通过图像分析对细胞生长进行监测。该专利虽然提到将刃天青作为氧化还原指示剂使用，但未提供具体使用方法，权利要求中也未包括。国际专利申请WO03016556(Measurement of microbiological activity in anopaque medium，2003年)针对金属冶炼流体(Metal Working Fluids)的高散射性质，通过测量未反应荧光物质和已反应荧光物质浓度并计算二者比率，来反映流体中微生物活性。美国专利5055411(Methods used in testing human males for fertility，1991年)和美国专利5068089(Kit for testing human males for fertility，1991年)利用刃天青的氧化还原颜色反应，建立了一个人精液活性检测方法。该方法中反应在试管中完成，并用与标准色板(Color Chart)对比的方法得到检测结果。美国专利5766875(Metabolic monitoring of cells in a microplate reader，1998年)采用双波长方法和不同pH指示剂，利用细胞代谢对生长环境pH的影响，在微孔板上检测细胞代谢活性。国际专利申请WO0198531(Resazurin-based cytotoxicity assay，2001年)利用活肝细胞和活肝细胞株(HepG2)能首先将刃天青转化为荧光化合物试卤灵(第一信号)，再将试卤灵进一步转化为非荧光化合物(第二信号)的代谢特性，测定死亡细胞数量。该方法可应用于肝癌药物筛选和药物毒性研究。Ahmed等(A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor anddetermine the proliferation of 1ymphocytesan alternati本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞培养基优化的方法，其特征在于，该方法包括步骤：ａ．将细胞接种到多孔板中的不同成分的培养基中，所述培养基为至少２种；ｂ．在相同条件下培养这些细胞；ｃ．检测活细胞数；和ｄ．选择活细胞数最多的培养基作为优选 培养基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈秉谦，贡向辉，杨胜利，
申请(专利权)人：上海中科伍佰豪生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]