一种鱼生长激素蛋白活性的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种新的、适合于构建鱼生长激素蛋白活性检测用细胞模型的鱼生长激素受体及其编码基因。将所述的鱼生长激素受体基因转入到宿主细胞ＣＨ０后，获得可表达鱼生长激素受体的重组ＣＨ０细胞，该细胞所表达的鱼生长激素受体保留有良好的生物学构型，因而可良好地应用于检测鱼生长激素蛋白的活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，更具体的，本专利技术涉及用于检测鱼生长激 素蛋白活性的蛋白、多核苷酸、重组细胞以及检测方法。
技术介绍
鱼生长激素是由鱼脑下垂体前叶细胞分泌的一种单链蛋白质，鱼生长激素 最基本的生理功能是促进鱼体生长和参与多种促合成代谢作用，鱼生长激素能 够促进鱼体蛋白质的合成，产生正氮平衡，提高肝脏或肌肉细胞对氨基酸的吸收率和RNA的合成率，达到提高食物的转化率，从而促进鱼体生长的目的。而 且，重组方法获得的外源鱼生长激素也能够增加鱼体蛋白质的合成，增强鱼体 对饵料中某些必需氨基酸的吸收，提高鱼肝脏脂肪分解酶活力，促进脂肪的分 解以作为能量物质促进鱼体生长，还能提高鱼体的抗病能力。研究表明外源鱼 生长激素在鱼类等水产品体内不会产生积累，食用这些水产品后也不会对人体 的代谢产生影响和干扰，这为水产养殖提供了前提。因此鱼生长激素在鱼类养 殖领域具有极大的应用价值，因而越来越受到重视。随着基因技术的发展和成熟，利用重组表达法生产鱼生长激素越来越多。 但是，利用不同的载体、不同的细胞、在不同的条件下完成的重组表达所获得 的鱼生长激素的活性存在很大的差异，因此需要一种稳定、快速、简单的活性 鉴定模式。鱼生长激素蛋白最主要的生物效应是促进鱼体生长，因此，对其活性的检 测，现有的方法很多是通过鱼生长激素对鱼体注射、浸泡、埋植、灌喂和投喂 等方式，检测其是否具有促生长的作用。这些方法虽然是最直接的，但在实际 检测中存在很多不利因素。注射、埋植和灌喂操作繁琐，耗时较多。浸泡、投 喂存在鱼生长激素用量过大，促生长效果受多种因素干扰的缺点，这是由于鱼 生长激素蛋白在鱼类消化道内会被蛋白酶分解而失去部分生物活性所致。这些 在鱼体水平的活性检测方法，共同的缺点是检测周期长，而且检测结果重复性不好，因为鱼体的生长是受鱼体自身、营养、环境等多因素影响的复杂过程， 所以检测的实验条件难以统一、标准化。因此，在鱼生长激素蛋白活性检测这一领域，迫切需要一种简便高效，周 期短，重复性好，实验条件统一的检测方法，为鱼生长激素活性评价提供新的 途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鱼生长激素受体蛋白，所述的鱼生长激素受体在CH0细胞上表达可保留良好的生物学结构，从而可灵敏地检测鱼生长激素蛋 白的活性。本专利技术的另一目的在于提供一种在细胞水平上检测鱼生长激素蛋白活性 的方法。在本专利技术的第一方面，提供一种分离的鱼生长激素受体蛋白，所述的蛋白 具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。在本专利技术的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述 的蛋白。在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO: l所示的核苷酸序列。 在本专利技术的第三方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的多核苷酸。 在本专利技术的第四方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述的载 体；或所述的宿主细胞上表达有所述的鱼生长激素受体蛋白。 在另一优选例中，所述的宿主细胞是CHO细胞。在本专利技术的第五方面，提供所述的宿主细胞的用途，用于检测鱼生长激素 蛋白活性。在本专利技术的第五方面，提供一种检测鱼生长激素蛋白活性的方法，所述方法 包括步骤(1) 培养所述的宿主细胞，形成表达鱼生长激素受体的细胞的培养物；和(2) 将待测鱼生长激素蛋白加入到步骤(1)获得的表达鱼生长激素受体的细 胞的培养物中，检测所述细胞的生长和/或增殖情况，从而获知待测鱼生长激素的 活性。在另一优选例中，步骤(2)包括在测试组中，将待测鱼生长激素蛋白加入到步骤(1)获得的表达鱼生长激素受体的细胞的培养物中；和检测测试组的培养物中细胞的生长和/或增殖情况，并与对照组比较，其中 所述的对照组是不添加待测鱼生长激素蛋白的表达鱼生长激素受体的细胞的培养 物；其中，如果测试组中细胞的生长和/或增殖在统计学上快于对照组，就表明 该待测鱼生长激素蛋白具有活性；或者，根据测试组中细胞的生长和/或增殖比对照组快的程度来评估待测鱼生长激素蛋白活性的强弱。在另一优选例中，在步骤(2)中，将待测鱼生长激素加入到表达鱼生长激素 受体的细胞的培养物中16-48小时，检测所述细胞的生长和/或增殖情况。在另一优选例中，将待测鱼生长激素加入到表达鱼生长激素受体的细胞的培 养物中24-36小时，检测所述细胞的生长和/或增殖情况。在另一优选例中，在步骤(2)中，所述的待测鱼生长激素蛋白在培养物中的 终浓度为20-2000ng/raL。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。附图说明图l显示了 gcGHR转化细菌的重组载体的PCR和酶切产物电泳结果，其中泳道1: DNA分子量标准，选用TaKaRa公司的人-HindIII消化；泳道2:重组载体的PCR扩增产物；泳道3:以pcDNA3. 1空载体作为模板的PCR反应；泳道4:重组载体的双酶切产物；泳道5: pcDNA3. 1空载体单酶切产物。图2显示了 CH0-gcGHR细胞总西A的RT-PCR扩增产物电泳结果，其中 泳道1:DNA分子量标准，选用Ferraentas公司的GeneRuler , 100bp LadderPIUS;泳道2: CH0-gcGHR细胞RT-PCR扩增出的actin片段；泳道3: CHO-gcG服细胞RT-PCR扩增出的gcGHR片段；泳道4: CHO-gcGHR细胞RT-PCR反应的阴性对照；泳道5: CH0-K1细胞RT-PCR扩增出的actin片段；泳道6: CH0-K1细胞RT-PCR扩增gcGHR的反应； 泳道7: CH0-Kl细胞RT-PCR反应的阴性对照。图3显示了 CHO-gcGHR细胞总蛋白的Western Blot结果，其中泳道l:蛋白分子量标准，选用Fermentas公司的预染Marker;泳道2: CH0-K1细胞蛋白Western Blot结果；泳道3: CHO-gcGHR细胞蛋白Western Blot的阴性对照；泳道4: CHO-gcGHR细胞蛋白Western Blot检测出gcGHR蛋白的结果。图4显示了鱼生长激素促细胞增殖活性检测。具体实施方式本专利技术人经过大量的筛选和反复的试验，找到一种特别适合于构建鱼生长 激素蛋白活性检测用细胞模型的鱼生长激素受体，其来源于草鱼 (a朋o; 力s2T/7^^o;7 jVe77a)，其氨基酸序列和DNA序列与目前已有的鱼生长 激素受体蛋白的序列均不同。将所述的鱼生长激素受体基因转入到宿主细胞 CH0后，获得可表达鱼生长激素受体的重组CHO细胞，该细胞所表达的鱼生长 激素受体保留有良好的生物学构型，较之利用同样方法表达于细胞上的其它鱼 生长激素受体具有更高的灵敏度，因而可良好地应用于检测鱼生长激素的活 性。在此基础上完成了本专利技术。草鱼生长激素受体蛋白及其编码基因如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的 物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多 肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其 他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，"草鱼生长激素受体蛋白或多肽"是指草鱼生长激素受体蛋 白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技 术人员能用标本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的鱼生长激素受体蛋白，其特征在于，所述的蛋白具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡炜，龚毅，
申请(专利权)人：上海中科伍佰豪生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]