测量人体生长激素的方法技术

根据分子量约为２２０００的人体生长激素（２２Ｋ ｈＧＨ）和分子量约为２００００的人体生长激素（２０Ｋ ｈＧＨ）在血液或尿中的浓度的比率，测量已施用的ｈＧＨ在血液中的浓度；或者根据２２Ｋ ｈＧＨ和２２Ｋ ｈＧＨ在血液或者尿中的浓度之间的比率判断是否已施用了ｈＧＨ。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及测定外部施用的人体生长激素在受检验者的血液或尿中的浓度的方法；以及确认人体生长激素的外部施用的方法。更具体地说，上述方法包含的步骤有(a)对在外部施用至少一种人体生长激素的受检验者的血液或尿中的2种人体生长激素的各自浓度进行测量，(b)计算它们的比率，以及(c)测定外部施用的人体生长激素的浓度或者确认外部施用。这些方法还可以包含的步骤有(ⅰ)对在没有施用人体生长激素的正常状态受检验者的血液或尿中两种类型的人体生长激素的各自浓度进行测量。(ⅱ)计算在步骤(ⅰ)中所测量的它们的浓度之和以及人体生长激素中的某一种或每一种的浓度对于经此得到的总浓度的比率，(ⅲ)在至少施用一种人体生长激素之后或者在怀疑施用了人体生长激素时，对受检验者的血液或尿中的两种类型人体生长激素的每种浓度进行测量，(ⅳ)计算在步骤(ⅲ)中所测量的它们的浓度之和以及人体生长激素中的某一种或每一种的浓度对经此得到的总浓度的比率，(ⅴ)通过比较在步骤(ⅱ)中得到的比率和在步骤(ⅳ)中得到的比率，测定外部施用的人体生长激素的浓度或者确认外部施用。据知有两种人体生长激素(缩写hGH)，它们是通过根据相同基因可变剪接生成的，其中一种具有的分子量约22000(缩写为22K hGH)，另一种具有的分子量约20000(缩写为20KhGH)。22KhGH是一种包含191个氨基酸的蛋白质。还已知这种22KhGH占血液中hGH总量的约90％。另一方面，20KhGH是包含176个氨基酸的蛋白质。在血液中出现的20KhGH与22KhGH相比数量较少，据推算约占血液中hGH总量的10％。20KhGH和22KhGH都是由原本相同的基因编码的蛋白质。因此，两种蛋白质的结构即它们的氨基酸序列是十分相似的。它们之间的差别仅在于，20K hGH的结构中缺失了15个氨基酸残基，它们对应于距离22KhGH中的N末端的第32到第46位氨基酸残基。通过利用重组DNA技术，已大量地制取22K hGH十年以上，并已得到其特异性抗体。这就导致特异性针对22K hGH的免疫化学测定方法的发展。另一方面，难于利用重组DNA技术来表达20K hGH，因此不可能得到具有与天然类型的20K hGH相同结构的高纯度的大量的重组20K hGH。因此，没有提供特异性测量20KhGH的方法。然而，通过利用大肠杆菌转化体，最近已研究出一种能够高纯度和大量地得到天然类型的20 K hGH的方法(Uchida等人.，J.Biotechnology:55:101-112(1997))。此外，已经制取单克隆抗体，其特异性地与天然类型的20K hGH反应而基本上不与22K hGH发生交叉反应，还研究出一种通过利用这样的特异性针对20K hGH的抗体来测量20K hGH在血液中的浓度的方法(EPPublication No.0814091)。最近，由于已相对大量地提供22K hGH,22K hGH的各种生理活性已被进一步揭示出来。首先，hGH被用于治疗生长激素不足的儿童疾病，然而，hGH治疗已表明对于这种疾病正像成年人生长激素不足一样是费用很高的。目前，hGH治疗已进一步针对不是由于hGH分泌缺乏引起的侏儒症，以及针对烧伤和/或受伤、手术后状态不良、骨质疏松等。如果在这些疾病治疗的临床研究中采用hGH，就必须掌握外部施用的hGH的状态。然而，倘若病人并不完全缺乏hGH，由于病人产生的hGH保留在血液中，仅通过测量血液中的hGH浓度来确定血液中hGH浓度值与在病人内源性生成的hGH(称之为生理性hGH)有关还是与外部施用的hGH有关是困难的。迄今不知道在这种情况下的测量方法。另一方面，hGH已被用作药物。作为近些年来运动禁服药物之一，人们还公知hGH是药物测试的对象。然而，简单地根据通过测量得到的血液中hGH浓度的高低，仍难以确定受检验者是否已经施用hGH，原因如下(1)对hGH检测是困难的，这是因为它在血液中的浓度非常低，即使对于与20K hGH相比，在血液中的量比较高的22K hGH，也只有几纳克/毫升到几十纳克/毫升。(2)即使能够检测hGH，它在血液中的浓度随个体、性别和年纪也是明显不同的。(3)由于hGH是由垂体间歇性地分泌的，即使对同一受检验者，在不同时间抽出的血液中的hGH浓度也是不同的。此外，由于hGH诱发的次级生理反应对不同个体、性别和年纪是极为不同的，还由于次级生理反应和外部施用的hGH之间的相互关系被认为是复杂的，血液中的hGH浓度自身并不能作为药物测试的适当指标。目前，22K hGH已是药物测试的测试目标。然而，据信22K hGH占有人体总hGH中的最大部分，因此，仅针对22K hGH的特异性测量不能提供药物测试的正确结果。根据对总hGH和22K hGH的血液浓度的分别测量，推算20K hGH约占血液中的总hGH中的约10％。然而，如上所述，由于最近才研究出特异性测量20K hGH的方法，因此还没有测量出22K hGH和20K hGH之间的严格的存在比率。因此，当然没有它们之间存在比率的日常变化或者由于如下因素引起的变化的资料(a)个体、性别和年纪的差别，以及(b)在耐量测试中由于hGH加速分泌所引起的血液中hGH浓度的升高。本专利技术的主题是提供一种测定或者判断是否外部施用了hGH的方法，以及一种测量血液或尿中的不包括生理性hGH的外部施用的hGH的浓度的方法，所述方法以血液或尿中的22K hGH和20K hGH浓度之比作为指数；或者利用了分别在正常状态(即没有施用任何hGH时)以及在已经施用激素之后所测量的22KhGH和20KhGH中的某一种或每一种的浓度与总的hGH浓度的比值。本专利技术人利用不同种类的人血浆和血清，分别用特异性针对22K hGH和20K hGH的测量方法，对22K hGH和20K hGH的血液浓度进行了测量，然后计算了它们的比率。此外，对于22K hGH和20K hGH的血液浓度之间的比率怎样随着各种因素变化进行了调查研究。结果表明，22K hGH和20K hGH各自的浓度随个体、性别和年纪有极大变化，它的日常变化也是很大的。还已发现，在某些情况下，按耐量测试得到的浓度明显地高。然而，还已首次发现，20KhGH(或22KhGH)的浓度对于总的hGH的浓度(22KhGH和20KhGH的浓度和)的比率对不同的个体、性别和年纪都几乎相同。我们惊讶地发现，虽然总的hGH浓度全天之中有很大变化，但上述比率几乎恒定，即使血液中的总的hGH浓度通过耐量测试而变化，所述比率并不因此受到很大影响。这些新的发现和结果还揭示，当对被检验者单独外部施用22K hGH或者20KhGH时，22K hGH和20 KhGH的血液浓度之间的比率在施用前后发生变化。这就使人相信，通过测量22K hGH和20K hGH的血液浓度和监测它们的比率，就能够测定或者判断是否已外部施用了hGH，并计算已经施用的hGH在血液中的浓度。此外，即使不用血液中hGH浓度而使用尿中hGH浓度作为测量的对象，预计也能得出相同的结论。因此，在本专利技术人的上述新认识的基础上完成本专利技术。即，本专利技术提供一种根据22K hGH和20K hGH在血液或尿中的浓度的比率测定hGH浓度的方法。本专利技术还提供一种根据22KhGH和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定施用的人体生长激素（ｈＧＨ）在血液中的浓度的方法，该方法是基于分子量约为２２０００的人体生长激素（２２Ｋ ｈＧＨ）在血液中的浓度和分子量约为２００００的人体生长激素（２０Ｋ ｈＧＨ）在血液中的浓度之间的比率进行测定的。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：桥本吉秀，河野直子，槙野正，入江实，
申请(专利权)人：先灵公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]