受环境溶氧浓度调控的大肠杆菌外源基因表达系统技术方案

本发明专利技术为一种受环境溶氧浓度调控的大肠杆菌外源基因表达系统，通过采用透明颤菌血红蛋白基因（Ｖｇｂ）的启动子元件实现发明专利技术目的，所构建的外源基因表达系统在调控模式上遵循Ｖｇｂ基因启动子的规律，在外源基因的表达水平上与现有表达系统的最高水平相当，适用于大体积高密度发酵并能应用于大量的重组蛋白质生产。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种通过微生物制造重组蛋白质的大肠杆菌外源基因表达系统，属于生物工程领域。大肠杆菌外源基因表达系统是基因工程疫苗，药物，动植物生长因子和工具酶等生物技术产品研究开发的关键技术之一。由于其遗传背景清楚，大部分基因元件的结构功能明确，对培养操作的外部条件宽容度大，因此该系统往往成为基因工程项目研究和生产的首选系统。目前已有不同调控模式的大肠杆菌外源基因表达系统问世可归纳为采用Lac，Tac启动子构建表达系统，其基因表达受乳糖及其类似物诱导。采用λ噬菌体的PL、PR启动子构建表达系统，其基因表达受cI蛋白抑制，在温度敏感突变体cI857存在的条件下，其基因表达受温度调控。采用Trp启动子构建表达系统，其基因表达受环境中低色氨酸浓度诱导。采用SP6、T7噬菌体的SP6、T7启动子构建表达系统，由Lac启动子控制SP6或T7RNA聚合酶的表达，其基因表达受乳糖及其类似物诱导。这些大肠杆菌外源基因表达系统一般适用于小规模制备重组蛋白质，当应用于大规模生产重组蛋白质时。化学信号诱导调控模式的缺陷是生产成本高，温度调控模式的缺陷是传热速度不能达到工艺要求。本专利技术的目的是建立一种受环境溶氧浓度调控的大肠杆菌外源基因表达系统，并且这种表达系统能适用于大体积高密度发酵并能应用于大量的重组蛋白质生产。本专利技术采用透明颤菌血红蛋白基因(Vgb)的启动子元件来达到专利技术目的，Vgb基因在大肠杆菌细胞内具有功能作用，其转录过程受高氧浓度抑制，在贫氧条件下被诱导。用Vgb基因的启动子直接控制外源基因虽然可实现由环境溶氧浓度来调控基因表达，但Vgb基因的启动子在大肠杆菌细胞内强度较弱，外源基因表达水平较低，应用价值不大。所以本专利技术的技术方案是构建一种用Vgb基因的启动子控制T7RNA聚合酶基因表达的低拷贝质粒和另一个由T7启动子控制表达外源基因的高拷贝质粒。通过DNA转化技术使二种质粒稳定地存在于大肠杆菌细胞内。构建成的外源基因表达系统在调控模式上遵循Vgb基因启动子的规律，在外源基因的表达水平上与现有表达系统的最高水平相当，因此有很大的应用前景。在以下内容中对专利技术的实现过程作进一步的详细描述1.化学合成寡聚核苷酸A和B，A序列为5′GAGGCCCTTTCGTCTTCAAG3′B序列为5′TTGCTGGTCTAACATGAGGGT3′。以寡聚核苷酸A和B为引物，含Vgb基因的质粒pBR322-Vgb为模板，在标准的聚合酶链反应(PCR)条件下得到大小为207bp的DNA扩增片段，该片段中含有Vgb基因的启动子。用限制性内切酶Hind III，Afl II酶解、Mungbean核酸酶处理该DNA片段后将其插入质粒pKK232-8的Sma I位点，得到质粒pKK-Pro。2.化学合成寡聚核苷酸C和D。C序列为5′TCAGGATCCAGGAGGACTAAATGAACACGATTAACATCGCTAAG3′，D序列为5′GCTGAAGCTTTTACGCGAACGCGAAGTCCGACT3′。以寡聚核苷酸C和D为引物，含T7RNA聚合酶基因的噬菌体l(CE6)DNA为模板，在标准的聚合酶链反应(PCR)条件下得到大小为2.7Kb的DNA扩增片段，该片段中含有完整的T7RNA聚合酶基因。用限制性内切酶BamH I，Hind III，酶解该DNA片段后将其插入质粒pKK-Pro的BamH I，Hind III位点，得到质粒pKK-T。3.用限制性内切酶Hind III酶解质粒pKK-T，Klemow酶补平粘端，再用限制性内切酶EcoR I酶解，琼脂糖凝胶电泳分离2.9Kb的DNA片段，该片段包含有在Vgb基因的启动子控制下的T7RNA聚合酶基因，将其插入低拷贝质粒pWSK129的EcoR I，EcoR V位点，得到质粒pTQ107。4.通过DNA转化技术将质粒pTQ107转化大肠杆菌菌株BL21。得到能受环境溶氧浓度调控，高水平表达外源基因的基因工程菌GJ100。以下为本专利技术的实施于表达原核、真核生物外源基因的例子实施例1将来自原核生物的金黄色葡萄球菌A蛋白基因插入带有T7启动子的pET系列质粒的多克隆位点中，得到高拷贝质粒pT7-ZZ。将质粒pT7-ZZ转化基因工程菌GJ100，得到金黄色葡萄球菌A蛋白表达菌株GJ100(pT7-ZZ)，经分析测定，在大于80％环境溶氧饱和度条件下，GJ100(pT7-ZZ)，用聚丙烯酰胺凝胶电泳难以被检测到，在2％-20％环境溶氧饱和度条件下，GJ100(pT7-ZZ)表达金黄色葡萄球菌A蛋白的相对含量可达细胞总蛋白的50％-60％。实施例2将来自高等真核生物的人白细胞介素II基因插入带有T7启动子的pET系列质粒的多克隆位点中，得到高拷贝质粒pT7-IL。将质粒pT7-IL转化基因工程菌GJ100，得到人白细胞介素II表达菌株GJ100(pT7-IL)。经分析测定，在大于80％环境溶氧饱和度条件下，GJ100(pT7-IL)外源基因的表达被抑制，用聚丙烯酰胺凝胶电泳难以被检测到，在2％-20％环境溶氧饱和度条件下，GJ100(pT7-IL)表达人白细胞介素II的相对含量可达细胞总蛋白的40％-50％。上述专利技术实现过程适用于表达其它原核、真核外源基因。本专利技术涉及的基因工程菌GJ100属于微生物，中文名称大肠杆菌GJ100，拉丁名称Escherchia coli GJ100，已于一九九七年四月二十六日起存放在中国武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NOM97006。权利要求1.一种可用于各种外源基因表达的大肠杆菌表达系统，其特征是含有一个能表达T7RNA聚合酶的低拷贝质粒和另一个由T7启动子控制表达外源基因的高拷贝质粒。2.如权利要求1所述的大肠杆菌表达系统，其特征是低拷贝质粒中的T7RNA聚合酶基因被置于透明颤菌血红蛋白基因(Vgb)的启动子控制之下。3.如权利要求1所述的大肠杆菌表达系统，其特征是先构建一个受Vgb的启动子调控，能表达T7RNA聚合酶基因的质粒pKK-T，用工具酶处理质粒pKK-T，可获得一个长度为2.9Kb的DNA片段，该片段包含有在Vgb基因的启动子控制下的T7RNA聚合酶基因，将其插入低拷贝质粒pWSK129中得到质粒pTQ107。转化大肠杆菌菌株BL21，得到基因工程菌GJ100。4.如权利要求3所述的质粒pKK-T，其特征是质粒pKK-T经过下列过程得到用聚合酶链反应扩增技术获得带有特定粘端的T7RNA聚合酶基因。将T7RNA聚合酶基因插入Vgb基因的启动子下游，得到质粒pKK-T。全文摘要本专利技术为一种受环境溶氧浓度调控的大肠杆菌外源基因表达系统,通过采用透明颤菌血红蛋白基因(Vgb)的启动子元件实现专利技术目的,所构建的外源基因表达系统在调控模式上遵循Vgb基因启动子的规律,在外源基因的表达水平上与现有表达系统的最高水平相当,适用于大体积高密度发酵并能应用于大量的重组蛋白质生产。文档编号C12N15/70GK1203276SQ9710648公开日1998年12月30日 申请日期1997年6月24日 优先权日1997年6月24日专利技术者龚毅, 童芹, 杨胜利 申请人:中国科学院上海生物工程研究中心本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可用于各种外源基因表达的大肠杆菌表达系统，其特征是含有一个能表达Ｔ↓［７］ＲＮＡ聚合酶的低拷贝质粒和另一个由Ｔ↓［７］启动子控制表达外源基因的高拷贝质粒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：龚毅，童芹，杨胜利，
申请(专利权)人：上海中科伍佰豪生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]