本发明专利技术涉及新型的重组人源化免疫毒素ｈＳ８３－Ｐ３４，该免疫毒素含有由人源化细胞毒性Ｔ细胞抗原４的抗原结合分子与人穿孔素的通道形成活性分子组成的融合蛋白。本发明专利技术的免疫毒素具有严格的靶向性，能避免对正常细胞的伤害，毒副作用小；不需经过内化及细胞内转运过程，作用效率高；不易产生相应抗体，免疫原性弱；不易产生耐药性。可用于治疗某些肿瘤和自身免疫性疾病，以及用于抑制器官移植时的免疫排斥反应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新型重组免疫毒素，具体地说涉及基于细胞毒性T细胞抗原4(Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4，CTLA-4)的抗原结合分子与膜活性毒素的通道形成活性小分子片段，通过基因重组构建的融合蛋白hS83-P34。本专利技术还涉及该免疫毒素的核苷酸序列和氨基酸序列。本专利技术还涉及包含该重组免疫毒素的药物组合物。
技术介绍
根据抗原与抗体，细胞因子、生长因子和激素与受体等相互识别原理，将对细胞有杀伤作用的分子与抗体等导向分子连接，构建成免疫毒素，可对细胞进行特异性杀伤，实现药物的靶向治疗。人源化细胞毒性T细胞抗原4(Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4，CTLA-4)是一种仅表达于活化T细胞而静止T细胞不表达的分子，在一些与T细胞相关的肿瘤细胞上也发现CTLA-4的表达(Tazzari PL et al.，The Journalof Immunology，2001，1674222-9)。因此，CTLA-4的抗原结合分子成为目前理想的导向分子之一，由之产生的免疫毒素只对活化T细胞或肿瘤细胞有杀伤作用，避免了对正常静息T细胞的非特异性损伤，不会使机体免疫力全面下降。目前，免疫毒素中的毒素分子大多为细菌毒素和植物毒素功能片段。目前使用的细菌毒素包括白喉杆菌毒素(Diphtheria Toxin，DT)N端388个氨基酸、绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin，PE)C端334个氨基酸(KreitmanRJ，Current Opinion in immunology，2001，11570-8)；植物毒素主要是蓖麻毒素A链(Ricin A Chain，RTA)，约291个氨基酸(Vitetta ES，Princess Takamatsu Symp，1988，19333-40)。基于这些毒素片段的免疫毒素在肿瘤、移植排斥等的治疗方面取得了一定效果，其中一种命名为ONTAK的分子，经临床验证后已通过美国FDA(食品与药品监督管理局)批准上市(Frankel AE et al.，Clinical CancerResearch，2000，6326-34)。但这些毒素存在以下缺点1、毒副作用大这些毒素本身对正常细胞有害，往往造成非特异损伤，即便经过分子修饰，毒性仍然存在(Onda M.et al.，The Journal of Immunology，2000，1657150-6)；2、作用效率低这些毒素都必须经过分子的内化，即穿透细胞膜，输送至细胞内才能启动一系列酶学反应导致细胞凋亡，而内化步骤往往不高，较大地影响了免疫毒素效用的发挥(Panchal RG.，Biochemical Phamacology，1998，55247-52)；3、免疫原性强这些毒素的分子量仍很大，有很强的抗原性，易产生抗体。而且人体内往往存在病原性细菌毒素的天然抗体，对天然毒素和修饰后的毒素都存在一定的中和效应，这必然使靶向分子的杀伤效率大大降低(Hall PD.et al.，Clinical Immunology，2001，100191-7)。4、易产生耐药性目前杀伤分子主要通过抑制胞内蛋白质合成的机制杀灭靶细胞，容易产生耐药性。除上述毒素外，还存在另一类不需内化、通过在细胞膜上形成通道而杀伤细胞的膜活性毒素，但对其结构认识的不足一直制约着它们的应用。随着研究的发展，越来越多膜活性毒素的结构和功能已被了解。研究发现，杀伤性T细胞用于清除非自身细胞或病变细胞的一种通道形成蛋白——穿孔素(Perforin)，仅由N端前34个氨基酸构成的结构域(简称P34)也具有通道形成能力(Ojcius DM.et al.，PNAS，1991，884621-5)。如果选择人穿孔素的通道形成活性小分子片段则可避免以往毒素带来的缺点。中国专利申请98113025.9公开了—种新的免疫毒素，该免疫毒素利用人源性毒素穿孔素(Perforin)的活性片段作为毒素分子，通过基因工程技术将毒素分子与载体分子的基因重组在大肠杆菌中表达出来。其优点是对人体不具有免疫原性，有严格靶向性，可直接激发细胞损伤过程，杀灭靶细胞，不需要内化及细胞内转运过程。其可用于治疗某些肿瘤和自身免疫性疾病，特别是适合用于抑制器官移植时的免疫排斥反应。在该专利技术中，与穿孔素的活性片段连接的分子为IL-2的基因片段。目前，尚没有相关文献涉及基于CTLA-4单链抗体和小分子通道形成肽的重组免疫毒素。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种重组免疫毒素，其含有由人源化细胞毒性T细胞抗原4的抗原结合分子与人穿孔素的通道形成活性分子P34组成的融合蛋白。本专利技术的另一个目的在于提供该重组免疫毒素的核苷酸序列和氨基酸序列。本专利技术的再一个目的在于提供包含该重组免疫毒素的药物组合物。根据本专利技术的一个方面，本专利技术的重组免疫毒素为一种采用基因工程方法构建的重组融合蛋白，由细胞毒性T细胞抗原4(Cytotoxic T LymphocyteAntigen 4，CTLA-4)的抗原结合分子与膜活性毒素的通道形成活性小分子片段通过基因重组构建。在本专利技术的一个具体实施方案中，该抗原结合分子为人源化细胞毒性T细胞抗原4的单链抗体，膜活性毒素的通道形成活性小分子片段可以是包括人穿孔素N端前34个氨基酸组成的通道形成结构域。该重组免疫毒素的构建利用人源化细胞毒性T细胞抗原4的单链抗体作为导向片段，人穿孔素N端前34个氨基酸组成的通道形成结构域作为杀伤片段。在本专利技术中，将本专利技术提供的重组免疫毒素蛋白简称为hS83-P34；将人源化细胞毒性T细胞抗原4的单链抗体蛋白简称为hS83；将人穿孔素N端前34个氨基酸组成的通道形成结构域蛋白简称为P34。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了编码该重组免疫毒素的核苷酸序列及其氨基酸序列，根据已知的Anti-CTLA-4-hS83和Perforin序列，设计相应的PCR引物，以人源性CTLA-4噬菌体抗体库中的阳性克隆Anti-CTLA-4-hS83为模板，分别扩增编码hS83基因的导向片段基因和编码P34基因的杀伤片段基因，并引入限制性内切酶(HindIII)酶切位点，将制备的编码hS83基因和编码P34基因连接，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列并编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。将连接后的基因克隆进入质粒pQE30，筛选获得含有编码hS83-P34基因的质粒载体pQE30-hS83-P34，再将获得的质粒载体转化大肠杆菌M15，获得转化的宿主细胞，该宿主细胞表达产物即为本专利技术的重组免疫毒素。本专利技术中使用的质粒载体pQE30中含有一段Met Arg Gly Ser His His HisHis His His Gly Ser Ala Cys Glu Leu氨基酸序列，相应地通过本专利技术构建的含融合基因的载体pQE30-hS83-P34所表达的蛋白中也含有这段氨基酸序列，如SEQ ID NO.3所示。Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ala Cys GluLeu序列的引入，一方面可以使所述重组免疫毒素因为改变了载体而高表达，另一方面也有利于纯化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人源化ＣＴＬＡ－４单链抗体与人穿孔素通道形成肽Ｐ３４的重组免疫毒素，其特征在于该免疫毒素含有由人源化细胞毒性Ｔ细胞抗原４的抗原结合分子与人穿孔素的通道形成活性分子组成的融合蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：卢晓风，程惊秋，曾令宇，万琳，丘小庆，陆燕蓉，李胜富，陈利弘，李幼平，步宏，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。