本发明专利技术公开了一种诱导落叶松属植物愈伤组织的方法及其专用培养基。该专用培养基，是含有下述成分的ＤＣＲ培养基：ＶＢ↓［１］０．４－０．６ｍｇ／Ｌ、ＶＢ↓［６］０．４－０．６ｍｇ／Ｌ、烟酸０．４－０．６ｍｇ／Ｌ、肌醇８０－１２０ｍｇ／Ｌ、谷氨酰胺３００－５００ｍｇ／Ｌ、水解酪蛋白４００－６００ｍｇ／Ｌ、２，４－二氯苯氧乙酸０．５－４ｍｇ／Ｌ、６－ＢＡ０．４－０．６ｍｇ／Ｌ、蔗糖２９．５－３０．５ｇ／Ｌ和琼脂６．５－７．５ｇ／Ｌ。本发明专利技术的方法诱导效果好、诱导率最高可达７１．４％，为以后的体细胞胚胎发生和器官发生等途径再生植株研究带来极大的方便，具有较大的实际应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种诱导落叶松属植物胚性愈伤组织的方法及其专用培养基。
技术介绍
目前，多种被子植物已经成功的进行体外繁殖，然而，松杉类植物的无性繁殖比其它物种要困难得多，比如，胚性组织的诱导大多来自于幼嫩的组织(如未成熟的胚)；体细胞胚的成熟及萌发严格依赖于外植体的基因型；苗的诱导率和转换率低，因此仍需要进一步的研究。松杉类植物胚性愈伤组织的诱导对培养基的各种成分和理化条件非常敏感，迄今为止还没有松杉类植物胚性愈伤组织有效诱导方法及有效的培养基，从而导致体细胞胚发生和器官发生等研究相对比较滞后。调整林木愈伤组织的培养基配方，改进诱导方法，显然对于体细胞胚胎发生和器官发生等无性繁殖，以及生态环境的保护具有重要意义。 日本落叶松(Larix leptolepis)原产日本，高可达30米，胸径1米，通过繁育，日本落叶松已在我国黑龙江到长江流域分布。其具有生长速度快，树干直，适应性强等特性，该品种可以当作绿化树种，用于公路、铁路和农田防护林，是林业生产上的主要木材树种，另外也是重要的造纸原料。日本落叶松可通过种子繁殖，但种子结实且具有明显的丰歉年，歉年则可能颗粒无收，满足不了大规模育苗用种的需要。发展无性林业是营造速生丰产用材的一个重要途径。利用组织培养方法对优树种材料进行扩大繁殖比常规的无性扦插具有更多的优点和潜力，它不受季节和取材数量等因素的制约，便于集约化和工厂化生产。利用组织培养技术加快繁殖，以满足林业生产和环保需要，具有重要的实践意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种诱导落叶松属植物愈伤组织的方法及其专用培养基。 本专利技术提供的诱导落叶松属植物愈伤组织的专用培养基，是含有下述成分的DCR培养基维生素B1(VB1)0.4-0.6mg/L、维生素B6(VB6)0.4-0.6mg/L、烟酸0.4-0.6mg/L、肌醇 80-120mg/L、谷氨酰胺(Glutamine) 300-500mg/L、水解酪蛋白(casein hydrolysate，CH)400-600mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5-4mg/L、6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.4-0.6mg/L、蔗糖29.5-30.5g/L和琼脂6.5-7.5g/L。 本专利技术提供的诱导落叶松愈伤组织的专用培养基，优选为含有下述成分的DCR固体培养基0.5mg/L维生素B1(VB1)、0.5mg/L维生素B6(VB6)、0.5mg/L烟酸、100mg/L肌醇、400mg/L谷氨酰胺(Glutamine)、500mg/L水解酪蛋白(caseinhydrolysate，CH)、2mg/L 2，4-D、0.5mg/L 6-BA、30g/L蔗糖和7.0g/L琼脂。 所述诱导落叶松愈伤组织的专用培养基的pH值为5.7-5.9，优选为5.8。 所述DCR培养基由大量元素、微量元素和铁盐成分组成，其中，大量元素340mg/LKNO3，556mg/L CaNO3·4H2O，400mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，85mg/LCaCl2·2H2O，370mg/L MgSO4；微量元素6.2mg/L HBO3，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，22.3mg/L Mn SO4·H2O，O.25mg/L Na2MoO4·2H2O，0.83mg/L KI，O.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2；铁盐成分5.57g/L FeSO4，7.45g/L Na2EDTA。 本专利技术提供的诱导落叶松属植物愈伤组织的方法，是将外植体在上述培养基上诱导培养。 所述外植体为种子幼胚，所述种子幼胚按照下述方法获得采摘处于子叶前合子胚时期的球果，放在4-6℃低温下冷藏26-30天，从球果中取出种子，并从种子中剥离出来的幼胚。 所述诱导培养条件为23-27℃，避光黑暗条件下培养。 所述诱导培养时间为26-32天，优选为28-30天。 本专利技术的方法及其专用培养基对所有落叶松属植物愈伤组织的诱导均适用，特别是对日本落叶松、华北落叶松、长白落叶松等胚性愈伤组织诱导效果较好。 本专利技术诱导落叶松愈伤组织的专用培养基含有的蔗糖和其他有机物组分是愈伤组织诱导和生长的主要营养物质，并用琼脂6.5-7.5g/L维持培养基的固态环境；采用激素的组合2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5-4mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.4-0.6mg/L，较高浓度的2，4-D有利于愈伤组织的诱导；此外，pH5.7-5.9的专用培养基为胚性愈伤组织的诱导和生长提供必需的微酸性环境。本专利技术的方法结合使用该专用培养基诱导落叶松属植物胚性愈伤组织，诱导效果好、诱导率达71.4％，为以后的体细胞胚发生和器官发生等研究带来极大的方便，具有较大的实际应用价值。 具体实施例方式 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 实施例1、日本落叶松胚性愈伤组织的诱导及其效果。 一、诱导培养基的配制 诱导培养基以DCR培养基为基本培养基，其组成为DCR+维生素B1(VB1)0.5mg/L+维生素B6(VB6)0.5mg/L+烟酸0.5mg/L+肌醇100mg/L+谷氨酰胺(Glutamine)400mg/L+水解酪蛋白(casein hydrolysate，CH)500mg/L+2，4-D2mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖(surcose)30g/L+琼脂(agar)7g/L，培养基pH值为5.8。 其中，DCR培养基的组成为大量元素340mg/L KNO3，556mg/L CaNO3·4H2O，400mg/L NH4NO3，170mg/L KH2PO4，85mg/L CaCl2·2H2O，370mg/L MgSO4；微量元素6.2mg/L HBO3，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，22.3mg/L Mn SO4·H2O，0.25mg/L Na2MoO4·2H2O，0.83mg/L KI，0.25mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/L CoCl2；铁盐成分5.57g/L FeSO4，7.45g/L Na2EDTA。 二、诱导日本落叶松愈伤组织 1、将胚发育至子叶前合子胚时期的未成熟日本落叶松球果采摘后，在4℃低温下冷存30天，然后从球果中取出种子，将种子用70％(体积百分含量)的酒精浸润1min，无菌水冲洗3次后，再放入0.1％(质量百分含量)的升汞溶液中灭菌5-10min，无菌水冲洗三次后，剥出的幼胚(子叶前合子胚)作为外植体，将外植体转入装有步骤一的诱导培养基的三角瓶(40ml培养基)中，每个三角瓶中外植体个数为6-8个置于黑暗的环境中，温度为25℃，诱导培养28天。观察愈伤组织形成情况，统计愈伤组织诱导率(愈伤组织诱导率＝产生愈伤组织的外植体数/接种外植体数)。同时以MS基本培养基替换步骤一制备的诱导培养基中的DCR基本培养基制成的诱导培养基作为对照，其他培养方法相同。 结果如表1所示，基本培养基为DCR比MS诱导频率更高，实验表明基本培养基为DCR诱导效果较好，诱导频率达71％。 表1.不同基本培养基对日本落叶松愈伤组织诱导频率的影响 2、按照步骤一的方法配制诱导培养基，其中，除2，4-D的浓度分别本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诱导落叶松属植物愈伤组织的专用培养基，是含有下述成分的ＤＣＲ培养基：维生素Ｂ↓［１］ ０．４－０．６ｍｇ／Ｌ、维生素Ｂ↓［６］０．４－０．６ｍｇ／Ｌ、烟酸０．４－０．６ｍｇ／Ｌ、肌醇８０－１２０ｍｇ／Ｌ、谷氨酰胺３００－５００ｍｇ／Ｌ、水解酪蛋白４００－６００ｍｇ／Ｌ、２，４－二氯苯氧乙酸０．５－４ｍｇ／Ｌ、６－苄氨基嘌呤０．４－０．６ｍｇ／Ｌ、蔗糖２９．５－３０．５ｇ／Ｌ和琼脂６．５－７．５ｇ／Ｌ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林金星，杨映根，郭仲琛，汪小雄，卢龙斗，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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