本发明专利技术公开了一种获得羽衣甘兰小孢子再生植株的方法及其专用培养基。该培养方法包括以下步骤：１）将小孢子接种于胚状体诱导培养基中，至终浓度为５×１０↑［４］－５×１０↑［５］个／ｍＬ，接着在３０－３５℃、黑暗条件下高温胁迫处理２４－７２小时后，再转入２４－２６℃、黑暗条件下诱导胚状体；２）待鱼雷期至子叶期胚状体形成后，将胚状体先在２４－２６℃、１５００－２５００Ｌｕｘ、１４－１８小时光照／天条件下继续培养５－１０天，再将胚状体接种于分化培养基中，在相同条件下培养；３）长出茎、叶后，将植株转接入生根培养基中，在２４－２６℃、１５００－２５００Ｌｕｘ、１４－１８小时光照／天条件下进行生根培养，得到羽衣甘兰再生植株。本发明专利技术将在羽衣甘兰的繁育及其品种改良中发挥重要作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物的小孢子培养方法及其专用培养基，特别是涉及获得羽衣甘兰小孢子再生植株的方法及其专用培养基。
技术介绍
植物具有杂种优势，因此目前的作物育种侧重在杂交育种上。这样一方面可以利用杂种的生长优势保证作物品种抗病高产，另一方面由于杂种的复杂遗传背景，使其不宜留种使用，从而能保护杂种研制者的利益。在杂交育种中，所用父母本材料的遗传背景必须是纯合的，经配种后才能得到性状一致的杂种。而要得到遗传背景纯合的亲本材料，在许多作物中都必须通过人工辅助自交授粉，经6-10年时间才能达到相对纯合，而且每代筛选材料由于杂合性遗传背景，选择的强度不能太高(避免优良隐性性状丢失)，从而造成筛选的群体量大，选出材料的可靠性及稳定性低，因此这种传统的杂交育种手段非常费时、费力。植物的雄性生殖细胞—花粉，由于经减数分裂后只带有一套亲本的染色体，是单倍性细胞，通过花药或未成熟花粉(小孢子)培养可以获得单倍体植株，再通过染色体加倍可成为双单倍体材料，这样可以使该植株的遗传背景达到完全纯合状态。这样一方面可以克服杂合状态时，显性基因对隐性基因的屏蔽作用，有利于隐性突变或基因重组性状的表达，获得更多的材料类型；另一方面可以一步获得纯合材料，进而可作为亲本材料应用于作物的杂交育种中。通常由小孢子培养来获得纯合材料仅需1-2年时间，不仅大大加速了育种进程，使育种效率也获得大幅提高，因此国际上对作物的单倍体育种研究非常重视，并已在小麦、大麦、油菜和白菜等多种作物上建立了良好的单倍体育种体系。 观赏用羽衣甘兰(Brassica oleracea var.acephala)属十字花科芸苔属甘兰类的观叶植物，又名“叶牡丹”，其着色叶球俯卧，如盛开的牡丹，雍容华贵，鲜艳亮丽，且抗寒性很强，近来在许多城市已成为秋冬至早春的主要景观地被植物。该植物杂种优势明显，生长势强，抗病性好，而且作为观赏植物，杂种一代能在最大程度上保证群体生长特性的一致性，整齐度和观赏价值均得到大幅提高，目前，杂交育种已成为主要的育种手段。但是，由于甘兰类植物是两年生植物，需要长时间严格的低温春化处理才能开花，传统育种中采用反复自交的方法获得纯合材料需要8-10年时间，不仅需时长，效率低，而且对于具有观赏价值的隐性性状难于捕获。迄今为止，有关羽衣甘兰的游离小孢子培养技术及其在育种中的应用，国内外尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于培养羽衣甘兰小孢子再生植株的培养基。 本专利技术所提供的用于培养羽衣甘兰小孢子再生植株的培养基，由胚状体诱导培养基、分化培养基和生根培养基3种培养基组成 其中，胚状体诱导培养基的配方为KNO3 100-150mg，Ca(NO3)2·4H2O 450-550mg，MgSO4·7H2O 100-150mg，KH2PO4 100-150mg，FeSO4·7H2O 27.5-28mg，EDTA·Na237-37.5mg，KI 0.8-0.85mg，CoCl2·6H2O 0.02-0.03mg，H3BO3 6-6.5mg，Na2MoO4·2H2O0.2-0.3mg，MnSO4·4H2O 22-22.5mg，CuSO4·5H2O 0.02-0.03mg，ZnSO4·7H2O 8.4-8.8mg，肌醇80-120mg，烟酸4-6mg，吡哆醇0.4-0.6mg，硫胺素0.4-0.6mg，甘氨酸1.8-2.2mg，叶酸0.4-0.6mg，生物素0.04-0.06mg，谷氨酰胺700-900mg，丝氨酸80-120mg，谷胱甘肽25-35mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)0.8-1.2mg，蔗糖100-150g，活性炭0.10-0.30g，用水定容至1L，pH 5.8-5.9； 分化培养基的配方为NH4NO3 1600-1700mg，KNO3 1850-1950mg，CaCl2·2H2O400-480mg，MgSO4·7H2O 350-400mg，KH2PO4 150-200mg，FeSO4·7H2O 27.5-28mg，EDTA·Na2 37-37.5mg，KI 0.8-0.85mg，CoCl2·6H2O 0.02-0.03mg，H3BO3 6-6.5mg，Na2MoO4·2H2O 0.2-0.3mg，MnSO4·4H2O 22-22.5mg，CuSO4·5H2O 0.02-0.03mg，ZnSO4·7H2O 8.4-8.8mg，肌醇80-120mg，烟酸0.4-0.6mg，吡哆醇0.4-0.6mg，硫胺素0.08-0.12mg，甘氨酸1.8-2.2mg，蔗糖25-35g，琼脂8-12g，用水定容至1L，pH 5.8-5.9； 生根培养基的配方为NH4NO3 800-850mg，KNO3 900-1000mg，CaCl2·2H2O200-240mg，MgSO4·7H2O 175-200mg，KH2PO4 75-100mg，FeSO4·7H2O 27.5-28mg，EDTA·Na2 37-37.5mg，KI 0.8-0.85mg，CoCl2·6H2O 0.02-0.03mg，H3BO3 6-6.5mg，Na2MoO4·2H2O 0.2-0.3mg，MnSO4·4H2O 22-22.5mg，CuSO4·5H2O 0.02-0.03mg，ZnSO4·7H2O 8.4-8.8mg，肌醇80-120mg，烟酸0.4-0.6mg，吡哆醇0.4-0.6mg，硫胺素0.08-0.12mg，甘氨酸1.8-2.2mg，蔗糖10-20g，琼脂8-10g，用水定容至1L，pH 5.8-5.9。 本专利技术的第二个目的是提供一种获得羽衣甘兰小孢子再生植株的方法。 本专利技术所提供的获得羽衣甘兰小孢子再生植株的方法，包括以下步骤 1)将小孢子接种于胚状体诱导培养基中，至终浓度为5×104-5×105个/mL，接着在30-35℃、黑暗条件下高温胁迫处理24-72小时后，再转入24-26℃、黑暗条件下诱导胚状体； 2)待鱼雷期至子叶期胚状体形成后，将胚状体先在24-26℃、1500-2500Lux、14-18小时光照/天条件下继续培养5-10天，再将胚状体接种于分化培养基中，在相同条件下培养； 3)长出茎、叶后，将植株转接入生根培养基中，在24-26℃、1500-2500Lux、14-18小时光照/天条件下进行生根培养，得到羽衣甘兰再生植株。 在上述培养方法中，步骤1)中优选的小孢子分离自含60％以上单核靠边期小孢子细胞和40％以下双核期小孢子细胞的花蕾；接种于胚状体诱导培养基中的小孢子浓度优选为105个/mL；高温胁迫处理条件优选为在33℃、黑暗条件下处理24小时；胚状体诱导温度优选为25℃。 步骤2)中将鱼雷期至子叶期胚状体先在25℃、2000Lux、16小时光照/天条件下继续培养7天。 步骤3)中的生根培养条件优选为25℃、2000Lux、16小时光照/天。 此外，为尽快使单倍体植株得到染色体加倍，可对步骤3)中得到的羽衣甘兰再生植株进行染色体倍性鉴定，并对单倍体植株的生长点部位用体积比为0.15-2.5％的秋水仙素连续处理36-60h，优选为48h，以使染色体加倍。 本专利技术提供了一种获得羽衣甘兰小孢子再生植株的方法及其专用培养基。该培本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于培养羽衣甘兰小孢子再生植株的培养基，由胚状体诱导培养基、分化培养基和生根培养基３种培养基组成：其中，胚状体诱导培养基的配方为：ＫＮＯ↓［３］１００－１５０ｍｇ，Ｃａ（ＮＯ↓［３］）↓［２］.４Ｈ↓［２］Ｏ４５０－５５０ｍ ｇ，ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ１００－１５０ｍｇ，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］１００－１５０ｍｇ，ＦｅＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ２７．５－２８ｍｇ，ＥＤＴＡ.Ｎａ↓［２］３７－３７．５ｍｇ，ＫＩ０．８－０．８５ｍｇ， ＣｏＣｌ↓［２］.６Ｈ↓［２］Ｏ０．０２－０．０３ｍｇ，Ｈ↓［３］ＢＯ↓［３］６－６．５ｍｇ，Ｎａ↓［２］ＭｏＯ↓［４］.２Ｈ↓［２］Ｏ０．２－０．３ｍｇ，ＭｎＳＯ↓［４］.４Ｈ↓［２］Ｏ２２－２２．５ｍｇ，ＣｕＳＯ↓［４］ .５Ｈ↓［２］Ｏ０．０２－０．０３ｍｇ，ＺｎＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ８．４－８．８ｍｇ，肌醇８０－１２０ｍｇ，烟酸４－６ｍｇ，吡哆醇０．４－０．６ｍｇ，硫胺素０．４－０．６ｍｇ，甘氨酸１．８－２．２ｍｇ，叶酸 ０．４－０．６ｍｇ，生物素０．０４－０．０６ｍｇ，谷氨酰胺７００－９００ｍｇ，丝氨酸８０－１２０ｍｇ，谷胱甘肽２５－３５ｍｇ，６－苄基腺嘌呤０．８－１．２ｍｇ，蔗糖１００－１５０ｇ，活性炭０．１０－０．３０ｇ ，用水定容至１Ｌ，ｐＨ５．８－５．９；分化培养基的配方为：ＮＨ↓［４］ＮＯ↓［３］１６００－１７００ｍｇ，ＫＮＯ↓［３］１８５０－１９５０ｍｇ，ＣａＣｌ↓［２］.２Ｈ↓［２］Ｏ４００－４８０ｍｇ，ＭｇＳＯ↓［４］.７ Ｈ↓［２］Ｏ３５０－４００ｍｇ，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］１５０－２００ｍｇ，ＦｅＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ２７．５－２８ｍｇ，ＥＤＴＡ.Ｎａ↓［２］３７－３７．５ｍｇ，ＫＩ０．８－０．８５ｍｇ，ＣｏＣｌ↓［２］.６Ｈ↓ ［２］Ｏ０．０２－０．０３ｍｇ，Ｈ↓［３］ＢＯ↓［３］６－６．５ｍｇ，Ｎａ↓［２］ＭｏＯ↓［４］.２Ｈ↓［２］Ｏ０．２－０．３ｍｇ，ＭｎＳＯ↓［４］.４Ｈ↓［２］Ｏ２２－２２．５ｍｇ，ＣｕＳＯ↓［４］.５Ｈ↓［２］Ｏ０． ０２－０．０３ｍｇ，ＺｎＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ８．４－８．８ｍｇ，肌醇８０－１２０ｍｇ，烟酸０．４－０．６ｍｇ，吡哆醇０．４－０．６ｍｇ，...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘凡，张月云，赵泓，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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