【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种定点突变创制耐寒黄瓜种质的方法。
技术介绍
1、黄瓜(cucumis sativus l.)，葫芦科双子叶植物，又称胡瓜或王瓜，起源于喜马拉雅山，具有喜温、喜湿、耐一定弱光的特点。在我国北方保护地蔬菜生产中，黄瓜是主要的蔬菜种类之一。但黄瓜是喜温蔬菜，起源于亚热带，对温度反应敏感。因此保护地生产中最大的生产障碍就是耐寒力低，经常出现低温冷害，对产量和品质影响很大。近年来，黄瓜的低温冷害问题受到了广泛关注，制定克服保护地中出现低温与弱光等不良天气影响的技术措施及选育耐寒黄瓜品种。科技界的研究力度也逐渐增大，包括低温下黄瓜的生理生化反应，对低温敏感性的变化规律以及对低温冷害的化学防护等方面内容。
2、由此可见，寒害显著影响黄瓜产量和品质。在我国黄瓜种植过程中，春提早、秋延后和周年生产中极易遭受低温危害，造成产量和品质下降甚至绝产，严重损害广大菜农的经济效益。因此，创制耐寒黄瓜新种质具有重要的经济和现实意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是创制耐寒黄瓜种质。
2、本专利技术首先保护一种培育耐寒黄瓜的方法，通过突变非耐寒黄瓜品种中csshi1蛋白的编码基因(即csshi1基因)来实现；
3、所述csshi1蛋白为a1)或a2)或a3)：
4、a1)氨基酸序列是seq id no：3所示的蛋白质；
5、a2)在a1)或a2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
6、a3
7、上述a2)中的蛋白质，标签具体如表1所示。
8、表1.标签的序列
9、
10、
11、上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
12、上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
13、上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将seq id no：1或seq id no：2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
14、上述方法中，所述突变可为将seq id no：1所示的csshi1基因突变为csshi1/-5bp；所述csshi1/-5bp是将seq id no：1自5’末端起第62-66位的核苷酸cgatg缺失，保持seq id no：1的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。
15、上述方法中，所述突变非耐寒黄瓜品种中csshi1蛋白的编码基因是通过将crispr/cas9系统导入黄瓜实现。所述crispr/cas9系统可包括表达靶向所述csshi1蛋白的编码基因的grna的dna分子的重组表达载体。
16、上述方法中，所述grna的靶标序列可为seq id no：1自5’末端起第56-78位所示。
17、上述方法中，所述重组表达载体可为重组质粒crispr/cas9-csshi1。重组质粒crispr/cas9-csshi1可为将seq id no：4所示的dna双链分子插入crispr/cas9载体的限制性内切酶bsal的识别位点，得到的重组质粒。
18、本专利技术还保护突变非耐寒黄瓜品种中上述任一所述csshi1蛋白的编码基因(即csshi1基因)的物质在培育耐寒黄瓜中的应用。
19、上述任一所述csshi1基因可为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)的dna分子：
20、(b1)编码区如seq id no:1所示的dna分子；
21、(b2)核苷酸序列如seq id no:1所示的dna分子；
22、(b3)核苷酸序列如seq id no:2所示的dna分子；
23、(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)限定的dna分子杂交且编码上述任一所述csshi1蛋白的dna分子；
24、(b5)来源于黄瓜且与(b1)或(b2)或(b3)限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码上述任一所述csshi1蛋白的dna分子。
25、所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
26、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
27、其中，seq id no:1由2001个核苷酸组成，seq id no:2由5755个核苷酸组成，seqid no:1所示的核苷酸编码seq id no:3所示的氨基酸序列。
28、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码上述任一所述csshi1蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本专利技术分离得到的上述任一所述csshi1蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述任一所述csshi1蛋白，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。
29、这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码氨基酸序列如seq id no:3所示的csshi1蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
30、上述应用中，所述突变可为将seq id no：1所示的csshi1基因突变为csshi1/-5bp；所述csshi1/-5bp是将seq id no：1自5’末端起第62-66位的核苷酸cgatg缺失，保持seq id no：1的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。
31、上述应用中，所述突变非耐寒黄瓜品种中csshi1蛋白的编码基因的物质可为如下b1)或b2)：
32、b1)抑制或降低所述csshi1蛋白的编码基因的表达的核酸分子；
33、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
34、上述应用中，b1)所述核酸分子可为表达靶向所述csshi1蛋白的编码基因的grna的dna分子或为靶向所述csshi1蛋白编码基因的grna。
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1.一种培育耐寒黄瓜的方法，通过突变非耐寒黄瓜品种中CsSHI1蛋白的编码基因来实现；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述突变为将SEQ ID No：1所示的CsSHI1基因突变为CsSHI1/-5bp；所述CsSHI1/-5bp是将SEQ ID No：1自5’末端起第62-66位的核苷酸CGATG缺失，保持SEQ ID No：1的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述突变非耐寒黄瓜品种中CsSHI1蛋白的编码基因是通过将CRISPR/Cas9系统导入黄瓜实现；
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述gRNA的靶标序列为SEQ ID No：1自5’末端起第56-78位所示。
5.突变非耐寒黄瓜品种中CsSHI1蛋白的编码基因的物质在培育耐寒黄瓜中的应用；
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述突变为将SEQ ID No：1所示的CsSHI1基因突变为CsSHI1/-5bp；所述CsSHI1/-5bp是将SEQ ID No：1自5’末端起第62-
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述突变非耐寒黄瓜品种中CsSHI1蛋白的编码基因的物质为如下B1)或B2)：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为表达靶向所述CsSHI1蛋白的编码基因的gRNA的DNA分子或为靶向所述CsSHI1蛋白编码基因的gRNA。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述gRNA的靶标序列为SEQ ID No：1自5’末端起第56-78位所示。
...【技术特征摘要】
1.一种培育耐寒黄瓜的方法，通过突变非耐寒黄瓜品种中csshi1蛋白的编码基因来实现；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述突变为将seq id no：1所示的csshi1基因突变为csshi1/-5bp；所述csshi1/-5bp是将seq id no：1自5’末端起第62-66位的核苷酸cgatg缺失，保持seq id no：1的其他核苷酸序列不变得到的dna分子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述突变非耐寒黄瓜品种中csshi1蛋白的编码基因是通过将crispr/cas9系统导入黄瓜实现；
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述grna的靶标序列为seq id no：1自5’末端起第56-78位所示。
5.突变非耐寒黄瓜品种中csshi1蛋白的编码基因的物质在培育耐寒黄瓜中...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏昌选，董瑞，温常龙，毛爱军，李颖，银珊珊，杨静静，张建，张晓飞，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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