【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法与应用。
技术介绍
1、1,5-戊二胺(1,5-diaminopentane)，即尸胺(cadaverine)，又称为1,5-二氨基戊烷，是生物胺的一种。最早由ludwig brieger在腐烂尸体中发现并因此得名。在细胞中，1,5-戊二胺是赖氨酸合成途径的衍生物，由l-赖氨酸经赖氨酸脱羧酶催化得到，是细胞内重要的生理功能因子。1,5-戊二胺在农业、医学和工业上有着广泛的应用。在农业上，应用于调节植物生长代谢，提高果实质量和产量；在医学上，应用于治疗痢疾的药物中；在工业上，1,5-戊二胺可与二元酸反应合成生物基高分子材料聚酰胺(尼龙，pa)，pa5.4，pa5.6和pa5.10等；与传统尼龙材料相比，生物基尼龙大大降低了生产成本，减少了化石燃料等不可再生资源的使用。
2、乙酸是一种重要的基础有机化学中间体，在化学工业中起着重要作用，由于其价格便宜且非常丰富，在生物合成中的使用可以降低原料的成本，从而以更经济的工艺进行生产，因此乙酸成为一种低成本的碳源来源。
3、目前已有研究利用乙酸合成琥珀酸、衣康酸、脂肪酸、异丙醇等高附加值化合物。因此通过代谢工程改造打通至戊二胺途径不仅能够实现乙酸的高效利用，也为戊二胺的生物合成提供了新思路。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供了一种基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法与应用，本专利技术首次实现了大肠杆菌利用乙酸合成戊二胺，
2、一种基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法，以大肠杆菌ka30为底盘细胞，在胞内引入乙酸同化途径，强化草酰乙酸合成途径以及天冬氨酸合成途径，获得质粒ptrc99a-glta-aceb-mdh-aspa-aspc和pcwj-acka-pta-cada，并一同转入到大肠杆菌ka30中获得高效利用乙酸合成戊二胺的重组菌株ka306。
3、作为改进的是，上述基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法，具体包括以下步骤：
4、步骤1，构建含有赖氨酸脱羧酶的质粒pcwj-cada
5、选取引物，通过pcr复制大肠杆菌ka30上的赖氨酸脱羧酶基因cada，并与载体pcwj连接后，转入克隆载体trans1-t1，经过lb平板初筛后，挑点进行菌落pcr验证后测序获得正确的质粒pcwj-cada；
6、步骤2，利用质粒pcwj-cada构建引入乙酸同化路径得质粒pcwj-acka-pta-cada；
7、步骤3，通过强化乙醛酸循环构建强化草酰乙酸合成质粒ptrc99a-glta-aceb-mdh；
8、步骤4，构建强化天冬氨酸合成途径质粒ptrc99a-glta-aceb-mdh-aspa-aspc，并与pcwj-acka-pta-cada共同转化至ka30中，获得重组菌株ka306。
9、进一步改进的是，步骤1中所述赖氨酸脱羧酶基因cada的核苷酸序列如seq idno.1所示。
10、seq id no.1
11、atgaacgttattgcaatattgaatcacatgggggtttattttaaagaagaacccatccgtgaacttcatcgcgcgcttgaacgtctgaacttccagattgtttacccgaacgaccgtgacgacttattaaaactgatcgaaaacaatgcgcgtctgtgcggcgttatttttgactgggataaatataatctcgagctgtgcgaagaaattagcaaaatgaacgagaacctgccgttgtacgcgttcgctaatacgtattccactctcgatgtaagcctgaatgacctgcgtttacagattagcttctttgaatatgcgctgggtgctgctgaagatattgctaataagatcaagcagaccactgacgaatatatcaacactattctgcctccgctgactaaagcactgtttaaatatgttcgtgaaggtaaatatactttctgtactcctggtcacatgggcggtactgcattccagaaaagcccggtaggtagcctgttctatgatttctttggtccgaataccatgaaatctgatatttccatttcagtatctgaactgggttctctgctggatcacagtggtccacacaaagaagcagaacagtatatcgctcgcgtctttaacgcagaccgcagctacatggtgaccaacggtacttccactgcgaacaaaattgttggtatgtactctgctccggcaggcagcaccattctgattgaccgtaactgccacaaatcgctgacccacctgatgatgatgagcgatgttacgccaatctatttccgcccgacccgtaacgcttacggtattcttggtggtatcccacagagtgaattccagcacgctaccattgctaagcgcgtgaaagaaacaccaaacgcaacctggccggtacatgctgtaattaccaactctacctatgatggtctgctgtacaacaccgacttcatcaagaaaacactggatgtgaaatccatccactttgactccgcgtgggtgccttacaccaacttctcaccgatttacgaaggtaaatgcggtatgagcggtggccgtgtagaagggaaagtgatttacgaaacccagtccactcacaaactgctggcggcgttctctcaggcttccatgatccacgttaaaggtgacgtaaacgaagaaacctttaacgaagcctacatgatgcacaccaccacttctccgcactacggtatcgtggcgtccactgaaaccgctgcggcgatgatgaagggtaatgctggtaagcgtctgatcaacggttccattgaacgtgcgatcaaattccgtaaagagatcaaacgtctgagaacggaatctgatggctggttctttgatgtttggcagccggatcatatcgatacgactgaatgctggccgctgcgttctgacagcacctggcacggcttcaaaaacatcgataacgagcacatgtatcttgacccgatcaaagtcaccctgctgactccggggatggaaaaagacggcaccatgagcgactttggtattccggccagcatcgtggcgaaatacctcgacgaacatggcatcgttgttgagaaaaccggtccgtataacctg本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法，其特征在于，以大肠杆菌KA30为底盘细胞，在胞内引入乙酸同化途径，强化草酰乙酸合成途径以及天冬氨酸合成途径，获得质粒pTrc99a-gltA-aceB-MDH-aspA-aspC和pCWJ-ackA-PTA-cadA，并一同转入到大肠杆菌KA30中获得高效利用乙酸合成戊二胺的重组菌株KA306。
2.根据权利要求1所述的一种基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤1中所述赖氨酸脱羧酶基因cadA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求2所述的一种基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤2中质粒pCWJ-ackA-PTA-cadA的构建步骤如下：通过选取引物， PCR复制大肠杆菌KA30上的乙酸激酶基因ackA和磷酸乙酰转移酶基因PTA，并与载体pCWJ连接后，转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序获得正确的质粒
5.根据权利要求2所述的一种基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤3中质粒pTrc99a-gltA-aceB-MDH的构建方法如下：选取引物，通过PCR复制大肠杆菌KA30上的苹果酸合成酶aceB，苹果酸脱氢酶基因MDH和柠檬酸合成酶gltA，再与载体pTrc99a连接，并转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序获得正确的质粒pTrc99a-gltA-aceB-MDH；其中，苹果酸合成酶aceB的核苷酸序列如SEQID NO.4所示, 苹果酸脱氢酶基因MDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，柠檬酸合成酶gltA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.根据权利要求2所述的一种基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤4中质粒pTrc99a-gltA-aceB-MDH-aspA-aspC的构建方法如下：通过以大肠杆菌KA30基因组为模板，通过PCR获得天冬氨酸解氨酶基因aspA和天冬氨酸转氨酶基因aspC，通过多片段同源同组连接到载体pTrc99a-gltA-aceB-MDH上，获得质粒pTrc99a-gltA-aceB-MDH-aspA-aspC，并将其与pCWJ-ackA-PTA-cadA，最后转化至大肠杆菌KA30中获得重组菌株KA306；其中，天冬氨酸解氨酶基因aspA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，天冬氨酸转氨酶基因aspC的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
7.基于权利要求1-6中任何一项基于乙酸合成戊二胺的工程菌株在戊二胺合成上的应用。
8.根据权利要求7所述基于乙酸合成戊二胺的工程菌株在戊二胺合成上的应用，其特征在于，在含有10 g/L的乙酸钠的发酵培养基中添加初始OD为0.1 的重组菌株，培养工程菌株OD600至0.5-0.7时，加入1mM的IPTG，每隔20h取样，监测其OD、乙酸消耗以及戊二胺的合成。
...【技术特征摘要】
1.一种基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法，其特征在于，以大肠杆菌ka30为底盘细胞，在胞内引入乙酸同化途径，强化草酰乙酸合成途径以及天冬氨酸合成途径，获得质粒ptrc99a-glta-aceb-mdh-aspa-aspc和pcwj-acka-pta-cada，并一同转入到大肠杆菌ka30中获得高效利用乙酸合成戊二胺的重组菌株ka306。
2.根据权利要求1所述的一种基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤1中所述赖氨酸脱羧酶基因cada的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4.根据权利要求2所述的一种基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤2中质粒pcwj-acka-pta-cada的构建步骤如下：通过选取引物， pcr复制大肠杆菌ka30上的乙酸激酶基因acka和磷酸乙酰转移酶基因pta，并与载体pcwj连接后，转入克隆载体trans1-t1，经过lb平板初筛后，挑点进行菌落pcr验证后测序获得正确的质粒pcwj-acka-pta；以pcwj-cada为模板，通过pcr获得cada片段，通过同源重组的方式连接至pcwj-acka-pta，获得质粒pcwj-acka-pta-cada；其中，乙酸激酶基因acka的核苷酸序列如seq idno.2，磷酸乙酰转移酶基因pta的核苷酸序列如seq id no.3所示。
5.根据权利要求2所述的一种基于乙酸合成戊二胺的工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤3中质粒ptrc99a-glta-aceb-mdh的构建方法如下：选取引物，通过pcr复制大肠杆菌ka...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈可泉，马晨曦，王静，王昕，朱彤彤，赵超，景浩天，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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