【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学及生物检测，具体用于血浆游离dna的甲基化研究，一种只需要1ng的微量血浆游离dna作为起始量来构建甲基化文库的方法。
技术介绍
1、早发现、早诊断和早治疗一直被认为是改善大多数癌症预后的关键，但是目前预测术后临床结果的临床和病理方法仍然有限，因此，寻找准确的生物标志物对癌症的早期诊断和准确的预后预测至关重要。血浆游离dna的甲基化研究是生命科学领域中一个备受关注的主题，其甲基化状态对癌症、其他疾病和生理过程的潜在影响是巨大的。血浆游离dna中的甲基化模式已被用于癌症的早期诊断和疾病监测。癌症细胞通常具有不同的dna甲基化模式，dna甲基化可以在血浆游离dna中检测到。但是现有方法中对于血浆量要求较高，最高需要10ml，最低也需要2ml，鉴于目前大量的临床血浆样本难以获取，因此亟需研发一种超低起始量血浆游离dna甲基化文库构建方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于针对血浆游离dna的特征，探索出一种新的血浆游离dna的甲基化文库构建方法，操作流程简单，重复性高，所需血浆量较少，所需血浆游离dna的量也很少。本专利技术只需要500ul血浆来提取血浆游离dna，采用1ng高质量的血浆游离dna进行甲基化文库构建，就能获得该样本中游离dna片段的长度信息，甲基化修饰等信息。
2、本专利技术所提供的技术方案为：
3、一种利用超低起始量血浆游离dna构建甲基化文库的方法，该方法主要包括以下步骤：
4、(1)血浆游离dna的提
5、首先，采集健康体检人全血或癌症患者全血并分离血浆；接着，利用magmaxtmcell-free dna isolation kit进行微量血浆游离dna的提取，并对试剂盒中的操作步骤进行改良，以提取更高质量的血浆游离dna用于甲基化文库构建。对操作流程做出以下修改：a)提前在37℃预热magmaxtmcell-free dna lysis/binding solution和magmaxtmcell-free dna wash solution；b)充分重悬magmaxtmcell-free magnetic beads并确保恢复至室温后再使用；c)用0.1x tae和magnetic beads重新结合一次血浆游离dna，以提高血浆游离dna的得率；最后对所提取的血浆游离dna进行浓度测定和质量检测，从而确定血浆游离dna的片段大小以及是否存在基因组大片段污染，若不存在污染，而且dna浓度高于0.1ng/ul，则进行下一步操作。
6、(2)血浆游离dna的末端修复和加a尾反应：
7、运用end repair enzyme mix在同一体系里对血浆游离dna进行末端修复和加a反应，以用于后续与末尾是t碱基的甲基化修饰接头连接，从而保持血浆游离dna原有的片段大小信息。反应完成后采用乙醇沉淀法纯化出cfdna。(3)血浆游离dna与甲基化修饰接头的连接：
8、所述甲基化修饰接头序列是由华大基因合成，然后按特定条件退火成分支状的特殊接头，其末尾是t碱基；甲基化修饰接头序列中的所有c都有甲基化修饰，避免在重亚硫酸氢盐处理步骤中被转化成u；adapter-top序列的3’末端有硫代修饰，能有效降低接头的突出粘性末端t的降解，这对接头与带a尾的血浆游离dna的高效率连接至关重要。adapter-bottom序列的5’端的磷酸基团修饰也能促进退火后的叉子形状的甲基化修饰接头与双链dna片段的连接。在所述cfdna与甲基化修饰接头连接完成后，再用磁珠法纯化出体系中的cfdna。接着，对cfdna与甲基化修饰接头连接的效率进行检测，根据qsep100的片段分布图判断甲基化修饰的接头是否与cfdna连接成功，若连接成功，则进行下一步操作。
9、所述的甲基化修饰接头序列为：
10、adapter-top sequence(从5'到3')：
11、acactctttccctacacgacgctcttccgatct
12、adapter-bottom sequence(从5'到3')：
13、gatcggaagagcacacgtctgaactccagtca
14、(4)重亚硫酸氢盐处理：
15、使用qiagen公司的epitect fast dna bisufite kit(59824)对血浆游离dna进行重亚硫酸氢盐处理，经过此步骤，血浆游离dna序列中的未甲基化的胞嘧啶(c)会被转化为尿嘧啶(u)，而甲基化的c保持不变。此试剂盒中具有独特的dna保护buffer，可保护dna在转化时不被过度片段化，且转化效率都能达到99％以上，可以有效区分甲基化和非甲基化位点。
16、(5)文库pcr和纯化筛选：
17、利用步骤(4)处理后的dna片段进行pcr扩增，文库pcr完成后，进行磁珠纯化筛选，然后洗脱，即可得到dna甲基化文库。文库pcr的循环数会对测序结果和数据质量产生重要影响。pcr循环数太低，文库中的dna片段可能不会被充分扩增，导致文库复杂性下降，某些片段可能无法被检测到；其次，可能导致文库中的dna分子的数量不足，测序数据量不够。pcr循环数过高，可能会导致dna片段被过度扩增，引入pcr偏差，降低了测序数据的准确性；过度扩增还可能导致重复片段增多，降低数据的信息含量。因此本专利技术根据连接效率的质检结果图来确定循环数，确保在达到满足测序深度40g所需的文库质量前提下用较低的循环数。
18、文库pcr所用引物的序列信息如下：
19、pe 1.0：
20、5’-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3’
21、pcr primer index 1：
22、5’-caagcagaagacggcatacgagattcgtgatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’
23、pcr primer index 2：
24、5’-caagcagaagacggcatacgagattacatcggtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’
25、pcr primer index 3：
26、5’-caagcagaagacggcatacgagattgcctaagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’
27、pcr primer index 4：
28、5’-caagcagaagacggcatacgagatttggtcagtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3’
29、pcr primer index 5：
30、5’-caagcagaagacggcatacga本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用超低起始量血浆游离DNA构建甲基化文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种利用超低起始量血浆游离DNA构建甲基化文库的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，利用MagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit进行微量血浆游离DNA的提取时，对操作流程做出以下修改：a)提前在37℃预热MagMAXTMCell-Free DNALysis/Binding Solution和MagMAXTMCell-Free DNA Wash Solution；b)充分重悬MagMAXTMCell-Free Magnetic Beads并确保恢复至室温后再使用；c)用0.1x TAE和Magnetic Beads重新结合一次血浆游离DNA，以提高血浆游离DNA的得率。
3.根据权利要求1所述的一种利用超低起始量血浆游离DNA构建甲基化文库的方法，其特征在于，所述步骤(2)完成后，采用乙醇沉淀法纯化出cfDNA。
4.根据权利要求1所述的一种利用超低起始量血浆游离DNA构建甲基化文库的方法，其特征在于，所述
5.根据权利要求1所述的一种利用超低起始量血浆游离DNA构建甲基化文库的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，分支状的甲基化修饰接头是将退火反应体系混匀后，采用98摄氏度水浴孵育5min，自然降至室温得到；所述退火反应体系中各反应物的配比具体见下表：
6.根据权利要求1所述的一种利用超低起始量血浆游离DNA构建甲基化文库的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，构建文库过程中，对扩增结果进行质检并根据质检结果图来确定循环数，确保在达到满足测序深度40G所需的文库质量前提下选用较低的循环数。
...【技术特征摘要】
1.一种利用超低起始量血浆游离dna构建甲基化文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种利用超低起始量血浆游离dna构建甲基化文库的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，利用magmaxtm cell-free dna isolation kit进行微量血浆游离dna的提取时，对操作流程做出以下修改：a)提前在37℃预热magmaxtmcell-free dnalysis/binding solution和magmaxtmcell-free dna wash solution；b)充分重悬magmaxtmcell-free magnetic beads并确保恢复至室温后再使用；c)用0.1x tae和magnetic beads重新结合一次血浆游离dna，以提高血浆游离dna的得率。
3.根据权利要求1所述的一种利用超...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆燕，易佳妮，刘鹏渊，李佳，周莉媛，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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