【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疫苗，更具体的说是涉及一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗及制备方法与应用。
技术介绍
1、禽传染性支气管炎(infectious bronchitis,ib)是由禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,ibv)引起的鸡的一种急性呼吸道疾病。ibv基因组非常容易发生变异和重组，导致血清型复杂且不同血清型间交叉保护效果差，给全世界养鸡业带来严重经济损失。ibv流行具有地域性，不同国家和地区在不同时间流行的ibv毒株也不同。目前，国内ibv处于lx4型占优、多基因型并存的现状，lx4承受的选择压力最大且自1999年以后即为优势基因型。
2、疫苗免疫是防控ib最有效的措施，但传统疫苗在安全性或免疫原性方面存在缺陷，无法提供完全有效的保护。弱毒疫苗存在毒力返强的风险，并可为ibv的基因重组提供条件。灭活苗存在灭活不全的危险，单价的灭活疫苗很难控制ibv变异株引起的ib暴发，往往需要制备多价油乳灭活疫苗，且存在使用量大、需配合佐剂使用、制备复杂、抗原结构易受破坏、成本较高等缺点。此外，由于流行毒株血清型与所用疫苗株不同，常常出现免疫偏差，导致免疫失败。因此，研发针对当地优势流行株的安全高效新型疫苗具有重要的现实意义。
3、ibv属冠状病毒科冠状病毒属，是不分节段的单股正链rna病毒。病毒粒子在电镜下呈圆形或多边形，有囊膜，直径在90nm～200nm，表面有长约20nm的棒状纤突。ibv有s、e、m及n四个结构蛋白。s蛋白由蛋白酶切割成s1和s2两个亚蛋
4、表位疫苗(epitope vaccine)，一般指利用生物信息学、结构生物学以及分子免疫学等多个交叉学科，筛选出病毒有效抗原表位并模拟其空间构象以间隔序列(linker)串联起来，应用基因工程技术进行体外表达或者人工合成微生物抗原表位高效表达并纯化后加入免疫增强剂将其制作成的疫苗。表位疫苗具有容易生产、工艺低廉、安全性高、稳定性好、能充分展示不同毒株的优势抗原表位、不是全病毒不具有散毒风险等优点，近年来备受科研工作者的青睐。但是，表位疫苗也有缺陷，例如免疫原性差、成本较为高昂、如何选择合适的载体进行高效表达、需要反复高剂量免疫方可产生较好的免疫应答反应等。目前，ibv结构蛋白优势抗原表位嵌合vlps的构建及其免疫机制的研究国内外还处于空白的状态。
5、因此，如何提供一种lx4优势基因型禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒并将其应用于疫苗制备中是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种lx4优势基因型禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒，其有效地刺激了固有免疫应答、体液免疫应答、细胞免疫应答和黏膜免疫应答以及提供更好的免疫保护效果，可应用于制备疫苗中，具有巨大的开发潜力。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗，制备方法包括以下步骤：
4、将表位多肽pep-eb表位、pep-eth表位和pep-ectl表位以多表位与ibv广西优势基因型(lx4型)和优势血清型(血清ⅰ型)代表性毒株gx-yl5的s1基因、s2基因的跨膜区和胞质尾区(tm/ct)以柔性肽串联，并化学合成基因片段rs-eb-th-ctl，如seq id no:4所示；
5、通过同源重组技术克隆到pfastbactm/hbm-topo重组转座载体，构建了pfastbactm/hbm-topo-rs-eb-th-ctl载体，转化dh10bac大肠杆菌感受态细胞，获得rhbm-rs-eb-th-ctl重组杆粒；
6、将重组杆粒转染sf9昆虫细胞，利用ifa、westernblot鉴定表达的重组蛋白；
7、上述构建并获得的分别表达ibv gx-yl5株重组s蛋白、m蛋白和e蛋白的重组杆状病毒rhbm-rs-eb-th-ctl、rhbm-m和rhbm-e共感染sf9细胞制备多表位嵌合vlps(rs-eb-th-ctlme-vlps)，纯化后进行westernblot、透射电镜和免疫电镜鉴定，成功制备ibv多表位嵌合vlps即rs-eb-th-ctlme-vlps。
8、进一步的，所述表位多肽pep-eb表位，如seq id no:1所示；
9、所述表位多肽pep-eth表位，如seq id no:2所示；
10、所述表位多肽pep-ectl表位，如seq id no:3所示；
11、进一步的，所述rhbm-m，如seq id no:13所示；
12、所述rhbm-e，如seq id no:14所示。
13、一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗在制备防治禽传染性支气管炎药物中的应用。
14、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
15、本专利技术巧妙利用柔性肽、s1和s2蛋白的跨膜区和胞质尾区蛋白的作用及vlps良好的抗原展示效果，将多个表位通过串联更加立体，高密度的表达嵌合在vlps表面，免疫原性更强，更加稳定。构建的多表位嵌合vlps既有vlps疫苗的优点，又有表位疫苗的优点，在一定程度上优于常规表位研究的表达质粒和蛋白的形式。
16、本专利技术研究内容较系统，对构建的多表位嵌合vlps免疫应答机本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
2.权利要求1所述一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述表位多肽Pep-EB表位，如SEQ ID NO:1所示；
3.权利要求1所述一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述rHBM-M，如SEQ ID NO:13所示；
4.一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗在制备防治禽传染性支气管炎药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
2.权利要求1所述一种禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述表位多肽pep-eb表位，如seq id no:1所示；
【专利技术属性】
技术研发人员：磨美兰，张愉，陈基明，范文胜，张桃妮，陈胜婷，韦平，黄鉴妮，黄腾，韦天超，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
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