极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种提高水稻抗病性的方法，具体是向水稻中转入外源nasod基因，所述nasod基因是编码极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白的基因。通过本发明专利技术的方法得到的转nasod基因水稻表现出优异的抗水稻白叶枯病。

High salt tolerance related protein of extreme halophilic bacteria and its application

The invention discloses a method for improving rice disease resistance, specifically transferring exogenous nasod gene into rice, and the nasod gene is a gene encoding extreme salt tolerant high salt tolerance related protein. The nasod transgenic rice obtained by this method shows excellent resistance to rice white leaf blight.

【技术实现步骤摘要】
极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白及其应用
本专利技术涉及一种提高水稻抗病性的方法，具体涉及向水稻中转入外源nasod基因，所述nasod基因是编码极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白的基因。
技术介绍
嗜盐古菌是一类生活在高盐环境中的古细菌。细菌视紫红质蛋白(bacteriorhodopsin.BR)是其细胞膜上的蛋白质，它具有典型的七次跨膜结构和光驱动质子泵功能，具有较高的发展前景和应用价值。极端嗜盐菌作为一种常见古菌，其分子水平的研究开展得相对较少，因此大量获取其基因资源，来研究它们的适应极端环境的机理显得尤为重要。极端嗜盐菌属于古菌，是和真核生物、细菌完全不同的生物类型，还远没有被人们认识，其本身作为一种全新生物资源具有广阔的研究价值和应用前景。耐受极端环境的分子机理一旦被破解，势必可以应用到医药和农业领域，大幅提高它们的生产和研究水平。目前有关极端嗜盐菌的研究主要局限于细菌的分离鉴别、一般组织化学、生化成分和基本生理指标。转基因植物是采用基因工程的手段将从动物、植物及微生物中获得或人工合成的外源基因整合到植物基因组中，使么稳定遗传并正确表达而获得的具有新的农艺性状的植物。随着农业生物技术的发展，转基因技术己被广泛运用于农业生产，在抗病、抗虫、抗逆育种等方面起着重要的作用。将外源基因转化植物后，我们还需要采用多种手段对获得的植株进行筛选和鉴定，获得阳性的转基因植株。首先，我们需要确定外源基因是否转入植物细胞，然后检测进入植物细胞的外源基因是否整合到植物的基因组W及其整合的方式，最后还需要检测整合到植物基因组中的外源基因是否转录和表达。
技术实现思路
本专利技术将编码极端嗜盐菌(Natrinemaaltunensesp.)高盐耐受相关蛋白的基因(以下称为nasod基因)，转入到水稻中，专利技术人的初衷是通过在水稻中转入nasod基因，提高水稻的高盐耐受能力，却惊异地发现，转nasod基因水稻具有很强的抗病能力，尤其是抗水稻白叶枯病，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术的一种实施方式是提供了一种转nasod基因抗病水稻的方法，所述nasod基因具有SEQIDNo.1所示碱基序列。本专利技术是对极端嗜盐菌AJ2在不同盐浓度下的蛋白表达差异入手，通过SDS-Page、HPLC、氨基酸测序、基因克隆等研究，获得了极端嗜盐菌AJ2的高盐耐受相关蛋白NASOD和相对应的nasod基因。并将nasod基因转入大肠杆菌表达，研究了NASOD融合蛋白提高大肠杆菌耐盐能力的影响。具体的，所述应用为：将编码极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白的基因转入宿主菌，使宿主菌表达极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白，得到具有耐高盐能力的重组菌株。然后从该重组菌株中鉴定出NASOD蛋白。将nasod基因通过常规转基因的方法，转入水稻，从而获得了转nasod基因水稻，并鉴定了转基因水稻T1株的水稻白叶枯病的性能。附图说明图1：pFGC5941质粒图谱。图2：nasod基因的扩增。图3：pFGC5941-nasod质粒的酶切验证。图4：T0代水稻的bar基因PCR检测。图5：T0代水稻的nasod基因PCR检测。图6：水稻叶片接种白叶枯病菌后病斑长度柱形图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：NASOD蛋白的分离纯化、氨基酸测序、基因克隆1)A.将极端嗜盐菌AJ2(由浙江大学生命科学学院微生物所吴敏教授馈赠)培养在1.7M和3.0MNaCl浓度下，在生长到指数生长中期时取样。进行SDS-Page分析和HPLC分析。结合两个分析结果，获得差异蛋白，并且用HPLC和SDS-Page纯化得到这个蛋白。B.氨基酸测序。获得NASOD氨基酸序列N端25个残基。2)a.通过blast比对，NASOD应该属于极端嗜盐菌SOD家族。根据已报道的嗜盐菌SOD序列，在保守区域设计简并引物(SOD-PF2：CTNCCVTACGACTACGAYGC，SOD-PR2：GTAGTAKGARTGYTCCCAGACG)，PCR扩增、测序得到nasodORF中间一段基因序列。b.以步骤a中获得的基因序列约500bp为模版，制备DNA探针(DIG标记法)，对AJ2的基因组DNA的XhoI酶切产物，做southern杂交，获得一个杂交信号。c.根据步骤b的southern杂交的结果，将杂交信号位置的基因组DNA的XhoI酶切产物回收，利用Taq酶补平末端，连接到T载体。转化大肠杆菌DH5a。将转化菌铺板。d.用步骤b的DNA探针，针对步骤c铺的板，做菌落杂交。选取杂交信号的单菌落测序。获得nasod的ORF全序列，以及其5’上游和3’下游序列。3)将第2步和第1步的结果比对，仅一个氨基酸序列的差异，可以认为是氨基酸测序的误差。最终获得nasod的ORF全长603bp(序列见SEQIDNo.1)，5’上游序列一共286bp，3’下游序列一共670bp。它编码200个氨基酸，分子量约22.4kDa。它推演的氨基酸序列中，具有已知极端嗜盐菌SOD的37个保守氨基酸残基中的35个。NASOD和已知极端嗜盐菌SOD在氨基酸上的同源性在70％～83％，表明这个蛋白属于极端嗜盐菌SOD家族的成员。NASOD作为SOD蛋白，与已知嗜盐菌以及其他物种的SOD蛋白应该具有超氧化物歧化酶功能。实施例2：转nasod基因水稻的制备日本晴(Nipponbare)和皖粳97均为实验室常规留种。质粒pFGC5941、大肠杆菌菌株DH5α、黄单胞杆菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)、农杆菌菌株EHA105、pMD18-T载体，均为实验室常规材料，或者是直接购买市售品。所述使用试剂以及酶，都为一般市售品，试验仪器为实验室常规试验仪器。引物合成与基因测序均委托杭州瑞普基因科技有限公司完成。试验方法和流程：1.制备大肠杆菌DH-5α感受态2.质粒的酶切与连接3.热击法转化大肠杆菌感受态4.质粒的提取5.制备根癌农杆菌EHA105感受态6.冻融法转化农杆菌7.水稻的遗传转化8.转基因水稻的PCR检测9.Southernblot检测10.转基因水稻叶片的总RNA提取11.荧光定量PCR法分析转基因水稻的表达量以上试验方法参考(Animprovedprotocolforefficienttransformationandregenerationofdiverseindicaricecultivars，KhirodKSahoo，AmitKTripathi，AshwaniPareek，SudhirKSoporyandSnehLSingla-Pareek，PlantMethods2011)。表1引物设计选取pFGC5941作为水稻遗传转化表达载体。通过PCR反应在引物的两端加上NcoI和BamHI两个酶切位点。以实验室保存的含有nasod基因的质粒pGEX-sod(可参见申请号200810163748.8的中国专利)为模版获得PCR产物，连接pMD-18载体，经测序正确后，同时酶切pFGC5941载体及pMD18-nasod，最后将目的片段和酶切载体连接起来。pFGC5941质粒图谱见图1，nasod基因片段见图2(M为1KbLadder)，酶切验证如图3所示(M为1KbLa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高水稻抗病性的方法，其特征在于，向水稻中转入外源nasod基因，所述nasod基因是编码极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白的基因。

【技术特征摘要】
1.一种提高水稻抗病性的方法，其特征在于，向水稻中转入外源nasod基因，所述nasod基因是编码极端嗜盐菌高盐耐受相关蛋白的基因。2.如权利要求1所述的方法，其中，外源nasod基因具有SEQIDNo.1表示的序列。3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述抗病性是抗水稻白叶枯病。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：朱诚，丁艳菲，江琼，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33