本发明专利技术属于基因工程和酶过程技术领域，具体涉及一种3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体及其应用。所述突变体是通过反向PCR进行定点突变获得的，突变后的3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体比酶活为190450.28U/mg，较野生型提高了315.73％。所提供突变体及突变位点为今后3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶及生物酶法高效催化生产甾体药物的研究提供了理论依据与技术保障。
A 3 phytosterone delta 1 dehydrogenase mutant and its application
The invention belongs to the field of genetic engineering and enzyme technology, in particular to a 3 phytosterone delta 1 dehydrogenase mutant and its application. The mutant PCR obtained through reverse mutation, mutation after 3 phytosterone delta 1 dehydrogenase mutant specific enzyme activity was 190450.28U/mg, increased by 315.73% compared to the wild type. The mutant and mutant loci provide theoretical basis and technical support for the future research on 3 phytosterone delta 1 dehydrogenase and biological enzyme catalyze the production of steroid drugs.
【技术实现步骤摘要】
一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体及其应用
：本专利技术属于基因工程和酶过程
，具体涉及一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体及其应用。
技术介绍
：甾体药物作为继抗生素之后需求量次多的药物，具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克作用，能改善蛋白质代谢、恢复和增强体力以及利尿降压，广泛用于治疗风湿性关节炎、支气管哮喘、湿疹等皮肤病、过敏性休克、前列腺炎、爱迪森氏等内分泌疾病，也可用于避孕、安胎、减轻女性更年期症状、手术麻醉等方面，以及预防冠心病、艾滋病、减肥等。目前甾体药物合成以化学合成为主，微生物转化为辅的工艺路线，包括甾体A环C1,2脱氢、甾体B环C7,8脱氢、9(11)α-羟基化等。微生物转化指通过微生物体内的相关酶系的催化反应而发挥作用。甾体药物具有环戊烷骈多氢菲母核，由于其结构复杂性，化学工艺存在许多弊端，包括工艺路线复杂、反应条件苛刻、副产物多、收率低等等。而酶法催化因其特异性强、反应条件温和，产率高等重要优势，已为许多甾体药物开发提供更加高效的策略。简单节杆菌(Arthrobactersimplex)来源的3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KsdD3),或称甾体C1,2脱氢酶，作用是使甾体A环C1,2脱氢，形成双键，是甾醇降解的关键酶。其含有1548bp的开放阅读框，编码515个氨基酸。本专利技术将野生型KsdD3化转到E.coliBL21(DE3)异源表达，上清经过Ni亲和层析和离子交换层析纯化后，进行酶学性质分析，表明其反应最适温度为30℃，最适pH为7.5，比酶活为45811.05U/mg，这与工业应用仍存在差距，因此通过对野生型分子改造使其酶活性提高，将有助于3-甾酮-Δ1-脱氢酶在工业生产甾体药物的推广。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种通过定点突变构建的酶活性提高的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体。本专利技术以简单节杆菌(Arthrobactersimplex)TCCC11037基因组为模板，克隆出3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KsdD3)基因，采用反向PCR进行定点突变获得编码突变体的基因mKsdD3，而后将编码突变体的基因进行异源表达获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶的突变体P139D。在本专利技术中采用如下定义：1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。2.3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如Pro139Asp，表示位置139的氨基酸由野生型的Pro替换成Asp，位置的编号对应于SEQIDNo.1中野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶的氨基酸序列编号；同样采用“原始碱基位置替换的碱基”来表示突变体中突变的碱基，位置的编号对应于SEQIDNo.2中野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶的核苷酸序列编号。在本专利技术中，KsdD3表示野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶的编码基因，mKsdD3表示3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体P139D的编码基因，信息如下表。用于表达所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的表达载体为pET28a(+)，用于所述表达载体转化的微生物宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)；本专利技术的实验步骤概述如下：(1)采用PCR技术以简单节杆菌TCCC11037基因组为模板，设计引物，扩增获取3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因(SEQIDNo.2)，通过密码子优化后(SEQIDNo.5)构建于pET28a(+)表达载体，得到KsdD3-pET28a；(2)以(1)中野生型重组载体KsdD3-pET28a为模板，通过反向PCR定点突变获得突变体P139D编码基因mKsdD3，测序鉴定mKsdD3；(3)将验证正确的突变体重组载体mKsdD3-pET28a通过化转转入大肠杆菌BL21(DE3)进行发酵培养，获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体P139D。所述发酵培养的方法，具体如下：(1)重组菌株接于LB培养基(含有50-80μg/mL卡那霉素)，37℃下220r/min培养12h后，以1％的接种量接于LB培养基(含有50-80μg/mL卡那霉素)，待菌浓度OD600＝0.6-0.8，加入IPTG，终浓度为0.5mM，在16℃，160r/min下诱导24h；(2)5000r/min离心收集菌体，重悬后超声破碎，低温高速离心(4℃,18000r/min)得到上清，即含有3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体；(3)高速离心上清经Ni-NTA亲和层析及离子交换色谱(GE-RESOURCETMQ)纯化后，得到3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体。有益效果：(1)本专利技术通过定点突变改造野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，使其甾体C1,2脱氢反应的活性提高。突变后的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体P139D比酶活为190450.28U/mg，野生型为45811.05U/mg，较野生型提高了315.73％。(2)本专利技术的3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体比酶活有较大幅度提高，所提供的突变位点为今后3-甾酮-Δ1-脱氢酶及生物酶法高效催化生产甾体药物的研究提供了理论依据与技术保障。附图说明：图1野生型和突变体重组载体琼脂糖凝胶电泳图其中，泳道1为野生型，泳道2为P139D；图2野生型和突变体SDS-PAGES其中，泳道1为野生型，泳道2为P139D；图3雄烯二酮催化过程示意图；图4转化率趋势变化图。具体实施方式：下面通过具体的实施方案叙述本专利技术方法。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。实施例1、3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的获得以简单节杆菌TCCC11037(简单节杆菌TCCC11037已公开在非专利文献《简单节杆菌groEL基因表达对大肠杆菌抗逆性能的影响》，生物技术通报，2016,32(5):180-186)基因组为模板，扩增获得野生型3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因KsdD3(SEQIDNo.2)，根据大肠杆菌BL21(DE3)进行密码子优化后得到SEQIDNo.5所示的序列，构建于pET28a(+)表达载体，得到KsdD3-pET28a，以KsdD3-pET28a为模板，以引物F(SEQIDNo.6)、和引物R(SEQIDNo.7)为引物，进行反向PCR获得mKsdD3,即SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，具体过程如下：采用东洋纺(上海)生物科技有限公司的KOD-Plus突变体试剂盒获得3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体：(1)PCR反应体系如下：模板(50ng/μL)1μL引物F(10pmol/μL)1.5μL引物R(10pmol/μL)1.5μL2mMdNTP5μL10×BufferforiPCR5μLKOD-Plus1μLddH2O35μLPCR反应条件：94℃预变性2min；98℃变性10sec；68℃延伸7.5min；8个循环后4℃下保存；通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测目标条带；(2)消化PCR产物中的模板在PCR反应液(50μL)中加入2μLDpnI，轻轻混匀后，置于本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.3所示。2.权利要求1所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的编码基因。3.权利要求2所述3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体的编码基因，其特征在于，如序列表SEQIDNo.4...
【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，秦慧民，毛淑红，王建文，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
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