植物种子转化方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域。外源ＤＮＡ进入植物基因组，目前主要有愈伤组织的农杆菌介导和基因枪法等技术。但是，受再生体系难、遗传背景差异导致转化率低下等因素，它们仍然处在不断的完善之中。物理手段的使用（如超声波、负压法、脉冲电泳、重离子辐照和γ射线辐照等）也同样存在使用材料有限、转化率低等主要问题。其中与本发明专利技术相近的γ射线辐照，因为辐照材料为愈伤组织，要考虑到再生体系、辐照时期和污染等问题，实际操作受到了很大限制。因此面对许多类型植物的转化技术，还需要进一步的不断改进。本发明专利技术的主要内容与技术特征是：将在γ射线辐照后的植物种子（剂量为：０．０１－１０Ｇｙ，剂量率：为０．１－２Ｇｙ／ｈ），转入携带目的基因质粒的农杆菌或外源ＤＮＡ（表达质粒）中悬浮液浸泡５－３００ｍｉｎ，然后，在选择性的基质中萌发；鉴定、筛选ＧＵＳ基因瞬间表达的幼苗：利用阳性幼苗可以用作两种后续的处理：一是作为外植体，在选择培养基上进行组织培养获得转基因再生植株；二是将阳性幼苗直接移栽盆内或田间，但其后，要每各３－５天，在各株的所有茎尖处，点滴５０－２００μｌ的相关抗生素（浓度为５０－２５０ｍｇ／ｌ），直至花芽的形成；收获种子进行外源基因鉴定，阳性材料进入下一代种植。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术专利属于生物

技术介绍
外源DNA进入植物基因组，目前主要有愈伤组织的农杆菌介导和基因枪法等技术。但是，受再生体系难、遗传背景差异导致转化率低下等因素，它们仍然处在不断的完善之中。物理手段的使用(如超声波、负压法、脉冲电泳、重离子辐照和γ射线辐照等)也同样存在使用材料有限、转化率低等主要问题。其中与本专利技术相近的γ射线辐照，因为辐照材料为愈伤组织，要考虑到再生体系、辐照时期和污染等问题，实际操作受到了很大限制。因此面对许多类型植物的转化技术，还需要进一步的不断改进。
技术实现思路
本专利技术专利的主要内容与技术特征是将在γ射线辐照后的植物种子(剂量为0.01-10Gy，剂量率为0.1-2Gy/h)，转入携带目的基因质粒的农杆菌或外源DNA(表达质粒)中浸泡5-300min，然后，在选择性基质中萌发；鉴定、筛选GUS基因瞬间表达的幼苗；利用阳性幼苗可以用作两种后续的处理一是作为外植体，在选择培养基上进行组织培养获得转基因再生植株；二是将阳性幼苗直接移栽盆内或田间，但其后，要每各3-5天，在各株的所有茎尖处点滴50-200μl的相关抗生素(浓度为50-250mg/l)，直至花芽的形成；收获种子进行外源基因鉴定，阳性材料进入下一代种植。 主要用途 本专利技术在多种植物，特别是在再生体系较难(如单子叶植物)、愈伤组织-农杆菌介导效果差(如十字花科的部分物种等)和转化效率低下等物种的转化上将发挥重要的作用，大大提高转化效率。本项专利技术在农业生物技术及其应用基础、植物基因组研究等方面有较大的应用价值。 具体实施方式 实例1 辐照种子的农杆菌介导gus基因的瞬间表达 1.1材料和方法 1.1.1材料 物种取饱满、完好的白菜、小麦、南瓜、芹菜、香菜、玉米、粳稻、籼稻、黑麦、菠菜、苋菜和豇豆等种子；每种取500粒左右供实验使用。 农杆菌及质粒为LBA4404；携带的质粒为pKUC(浙江大学舒庆尧教授实验室)；含抗生素选择基因为卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因；报告基因为GUS基因(含内含子序列)；它们的启动子均为CaMV 35S启动子。 1.1.2方法 种子辐照用0.01-10Gy剂量(剂量率为0.1-2Gy/h)的γ射线辐照植物种子。 摇菌农杆菌在LB液体培养基(其中含50mg/l卡那霉素)25℃条件下，120rpm摇床培养。指数增长的中后期，菌液OD550值为0.20-0.85时用做以下实验。 浸泡在农杆菌悬浮液中分别加入辐照处理和未处理的种子，在15-35℃条件下，浸泡5-300min。 萌发浸泡种子分别点播在含沙土或珍珠岩的盆内；期间，喷洒适量的无菌水(含50mg/L卡那霉素)以保湿润。 gus瞬间表达鉴定种子萌发，幼苗长到3cm高以上时(7-25天内)，剪下植株的少许叶片或根，切成0.5×0.5cm2大小或0.5cm长的小块转入GUS染色液中；在遮光条件下染色6-24小时，设置已知未转化材料为阴性对照和转化材料为阳性对照；染色后，用95％乙醇去叶绿素等物质，直至透明；出现兰色为阳性，否则为阴性，由于GUS基因含插内含子，因此可以排除由农杆菌自身造成的假阳性。染色液成分含0.1M K/NaPO4缓冲液，pH7.0；10mM EDTA-Na2；5mM K3[Fe(CN)6]；5mM K4[Fe(CN)6]·3H2O；0.1％(v/v)Triton X-100；1ml/mg X-Gluc；抽滤灭菌，-20℃保存。 gus基因表达率的计算。阳性表达率(％)＝GUS蓝色反应株数/浸泡后萌发的总株数。 1.2结果与分析 由表1可知，各个物种的未辐照或未经农杆菌介导的植株幼苗均没有检测出GUS反应阳性，表明实验材料存在的内源gus基因及其表达被排除。而经过辐照处理的种子，均表现了高低不等的阳性表达率，有的高达80％以上，这在专利技术者所能查阅的文献中，还没有过报道。 表1 辐照种子农杆菌介导后幼苗的gus基因瞬间表达率(％) 1.3结论 来源不同、遗传背景各异的植物种子，通过适宜的γ射线处理，在农杆菌悬浮液中，可以获得很高的外源DNA瞬间表达(如GUS阳性)的转化体。 实例2 辐照种子的外源质粒(gus基因)转化表现 2.1材料和方法 2.1.1材料 物种取饱满、完好的小麦、番茄、白菜和香椿等种子；每种取500粒左右供实验使用。 农杆菌及质粒为LBA4404；携带的质粒为pKUC(来自浙江大学舒庆尧教授实验室)；含抗生素选择基因为卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因；报告基因为GUS基因(含内含子序列)；它们的启动子均为CaMV 35S启动子。 2.1.2方法 种子辐照用0.01-10Gy剂量(剂量率为0.1-2Gy/h)的γ射线辐照植物种子。 摇菌农杆菌在LB液体培养基(其中含50mg/l卡那霉素)25℃条件下，120rpm摇床培养。指数增长的中后期，菌液OD550值为0.20-0.85时用于质粒的提取。 质粒的提取碱裂解法裂解农杆菌；异丙醇-乙醇粗提质粒；PEG沉淀法纯化质粒；溶于TE缓冲液(pH8.0)，-20℃保存。 浸泡用TE缓冲液将质粒稀释到20-350ng/ml浓度，然后分别加入辐照处理和未处理的种子，在15-35℃条件下，浸泡5-300min。 萌发浸泡种子分别点播在含珍珠岩的盆内；期间，喷洒适量的无菌水(含50mg/l卡那霉素)以保湿润。 gus瞬间表达鉴定种子萌发，幼苗长到3cm高以上时(7-25天内)，剪下植株的少许叶片或根，切成0.5×0.5cm2大小或0.5cm长的小块转入GUS染色液中；在遮光条件下染色6-24小时，设置已知未转化材料为阴性对照和转化材料为阳性对照；染色后，用95％乙醇去叶绿素等物质，直至透明；出现兰色为阳性，否则为阴性，由于GUS基因含内含子，农杆菌造成的假阳性可以排除。染色液成分含0.1M K/NaPO4缓冲液，pH7.0；10mM EDTA-Na2；5mM K3[Fe(CN)6]；5mM K4[Fe(CN)6]·3H3O；0.1％(v/v)TritonX-100；1ml/mg X-Gluc；抽滤灭菌，-20℃保存。 gus基因表达率的计算。表达率(％)＝GUS蓝色反应株数/浸泡后萌发的总株数。 2.2结果与分析 由表2可知，小麦、番茄、白菜和香椿的种子在未辐照或未经质粒转化的植株幼苗均没有检测出GUS反应阳性。而经过辐照处理的种子，在质粒转化下也表现了高低不等的阳性表达率，最低香椿也高达30％多。 表2 辐照种子质粒介导后幼苗的gus基因瞬间表达率(％) 2.3结论 同实例1辐照种子经过农杆菌介导的结果一样，辐照的种子在质粒直接转化下，也可以获得外源基因(如gus基因)瞬间表达率较高的转化体。 实例3 瞬间表达的幼苗盆栽-卡那霉素选择获得T0和T1代植株的表现 3.1材料和方法 3.1.1材料 材料来源取实例2的小麦、番茄、白菜和香椿等幼苗，经过GUS染色，选取兰色阳性植株用于移栽。 3.1.2方法 盆内移栽阳性植株移栽在含有肥沃沙土的盆内。每间隔3-5天，在所有茎尖上滴50-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
植物种子转化技术本专利技术专利的主要技术特征是：将在γ射线辐照后的植物种子（剂量为：０．０１－１０Ｇｙ，剂量率：为０．１－２Ｇｙ／ｈ），转入携带目的基因质粒的农杆菌或外源ＤＮＡ（表达质粒）中浸泡５－３００ｍｉｎ，然后，在选择性基质中萌发；鉴定、筛选ＧＵＳ基因瞬间表达的幼苗；利用阳性幼苗可以用作两种后续的处理：一是作为外植体，在选择培养基上进行组织培养获得转基因再生植株；二是将阳性幼苗直接移栽盆内或田间，但其后，要每各３－５天，在各株的所有茎尖处点滴５０－２００μｌ的相关抗生素（浓度为５０－２５０ｍｇ／ｌ），直至花芽的形成；收获种子进行外源基因鉴定，阳性材料进入下一代种植。

【技术特征摘要】
植物种子转化技术本发明专利的主要技术特征是将在γ射线辐照后的植物种子(剂量为0.01-10Gy，剂量率为0.1-2Gy/h)，转入携带目的基因质粒的农杆菌或外源DNA(表达质粒)中浸泡5-300min，然后，在选择性基质中萌发；鉴定、筛选GUS基因瞬间表达的幼苗；利用阳性幼苗可以用...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兴林，舒庆尧，路福平，夏英武，吴殿星，高年发，张健，崔海瑞，傅俊杰，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]