【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因，尤其是一种小g蛋白rab20的莱茵衣藻rab20多克隆抗体、制备方法与应用。
技术介绍
1、小g蛋白是存在于生物体内，在信号通路中发挥重要作用，参与调控各种生物学过程的重要调控蛋白，可通过结合和释放gtp使其处于活性和非活性状态，激活或关闭与效应蛋白的结合，从而调控下游信号通路。近几年研究表明，小g蛋白在纤毛组装、生成和纤毛信号转导过程中也具有重要作用，纤毛作为真核细胞的“信号天线”，利用其定位于纤毛膜的受体(如g蛋白偶联受体，gpcr)和离子通道以及其下游信号分子感应胞外信号并将其传输至细胞核，进而指导细胞应答，因此研究纤毛内小g蛋白对纤毛内蛋白运输的调控分子机制具有重要科学意义。
2、莱茵衣藻是一种细胞结构简单、生长周期短、遗传背景清楚的单细胞藻类，更因其鞭毛易于提取、纤毛结构和组成与人类及哺乳动物细胞高度保守的独特优势成为研究纤毛生成和纤毛信号转导的良好模式生物，经鉴定发现，在莱茵衣藻纤毛内有近40种小g蛋白存在，而大部分小g蛋白在纤毛内所发挥的功能尚不清楚。其中小g蛋白rab20是与膜运输和免疫反应有关的rab家族成员之一，其在细胞增殖、分化和细胞凋亡等生命活动中具有重要作用，但其调控的详细分子机制却尚不清楚。因此本研究拟制备莱茵衣藻rab20多克隆抗体，用于后续探究rab20在纤毛生成和纤毛信号转导过程中的调控功能。
3、目前市面上的多克隆抗体存在诸多问题，如：因为其宿主的不同，容易造成批次间存在差异的情况；因为其中大量的非特异性抗体，使得其在一些应用中产生背景信号的情况；各
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种小g蛋白rab20的莱茵衣藻rab20多克隆抗体、制备方法及应用。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种小g蛋白rab20的莱茵衣藻rab20多克隆抗体，所述多克隆抗体通过elisa测定抗血清效价为1:102400。
4、进一步地，所述多克隆抗体在免疫前血清未检测到任何蛋白，而经富集后的抗体，能够识别cc-125中内源rab20蛋白。
5、进一步地，所述多克隆抗体能够与莱茵衣藻中的rab20蛋白产生特异性结合，在红色荧光下能够观察到rab20定位于细胞基体和纤毛。
6、如上所述的多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
7、首先构建原核表达载体，并在c+感受态中表达纯化mbp标签的rab20蛋白作为免疫原进行动物免疫；3次免疫后取动脉血清，以间接elisa法测定抗血清效价，将mbp::rab20作为抗原和cnbr-activated sepharose 4b的beads结合，利用抗原抗体亲和纯化的方法对anti-rab20进行进一步纯化，即得。
8、如上所述的多克隆抗体在研究rab20在纤毛信号转导中的功能方面中的应用。
9、如上所述的多克隆抗体在变性蛋白检测方面中的应用。
10、如上所述的多克隆抗体在rab20突变体的鉴定和/或rab20转基因藻种的获得和/或rab20与纤毛蛋白的相互作用的分析方面中的应用。
11、如上所述的多克隆抗体在rab20的蛋白定位研究方面中的应用。
12、进一步地，利用所述多克隆抗体通过免疫荧光鉴定rab20蛋白主要定位在细胞基体内。
13、本专利技术取得的优点和积极效果为：
14、1、本专利技术多克隆抗体通过elisa测定抗血清效价为1:102400；通过protein a和抗原抗体亲和纯化后，获得特异性较强的多克隆抗体rab20；利用rab20抗体对莱茵衣藻野生型cc-125进行免疫荧光分析，发现rab20主要定位于细胞基体。综上，本专利技术制备了一支灵敏度高、特异性强、且优于市面多克隆抗体的rab20多克隆抗体，为后续研究rab20在纤毛信号转导中的功能提供了有力材料。
15、2、本专利技术为研究rab20在纤毛生成和纤毛信号转导过程中的调控功能，特制得一支特异性较强的莱茵衣藻rab20多克隆抗体。在制备时，首先构建原核表达载体，并在c+感受态中表达纯化6×his标签的rab20蛋白作为免疫原进行动物免疫。3次免疫后取动脉血清，以间接elisa法测定效价，将mbp::rab20作为抗原和cnbr-activated sepharose 4b的beads结合，利用抗原抗体亲和纯化的方法对前文中得到的anti-rab20进行进一步纯化。采用免疫印迹分析抗体的特异性和灵敏度，通过免疫荧光分析莱茵衣藻rab20的蛋白定位。本专利技术方法提高了莱茵衣藻rab20多克隆抗体特异性，同时消除了交叉现象。
16、3、本专利技术保留了现有多克隆抗体制备技术能够放大地表达水平的靶蛋白信号；能够识别多个表位，使得ip/chip中获得更好的结果；相对于单克隆抗体来说，多克隆抗体更能够容许抗原中的微小变化；可用于检测变性蛋白；多表位的结构使得其能够提供更有利的检测；制备过程相对简单，生产成本低，制备时间短等优势，也对其不足进行了优化与改善，例如，本专利技术方法使用品种优良，健康状态良好的成年新西兰大白兔很好的改善了批次间差异的情况，使用protein a和抗原抗体亲和纯化后，获得特异性较强的多克隆抗体rab20，且无交叉反应。
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1.一种小G蛋白RAB20的莱茵衣藻RAB20多克隆抗体，其特征在于：所述多克隆抗体通过ELISA测定抗血清效价为1:102400。
2.根据权利要求1所述的多克隆抗体，其特征在于：所述多克隆抗体在免疫前血清未检测到任何蛋白，而经富集后的抗体，能够识别CC-125中内源RAB20蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的多克隆抗体，其特征在于：所述多克隆抗体能够与莱茵衣藻中的RAB20蛋白产生特异性结合，在红色荧光下能够观察到RAB20定位于细胞基体和纤毛。
4.如权利要求1至3任一项所述的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
5.如权利要求1至3任一项所述的多克隆抗体在研究RAB20在纤毛信号转导中的功能方面中的应用。
6.如权利要求1至3任一项所述的多克隆抗体在变性蛋白检测方面中的应用。
7.如权利要求1至3任一项所述的多克隆抗体在rab20突变体的鉴定和/或RAB20转基因藻种的获得和/或RAB20与纤毛蛋白的相互作用的分析方面中的应用。
8.如权利要求1至3任一项所述的多克隆抗体在R
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：利用所述多克隆抗体通过免疫荧光鉴定RAB20蛋白主要定位在细胞基体内。
...【技术特征摘要】
1.一种小g蛋白rab20的莱茵衣藻rab20多克隆抗体，其特征在于：所述多克隆抗体通过elisa测定抗血清效价为1:102400。
2.根据权利要求1所述的多克隆抗体，其特征在于：所述多克隆抗体在免疫前血清未检测到任何蛋白，而经富集后的抗体，能够识别cc-125中内源rab20蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的多克隆抗体，其特征在于：所述多克隆抗体能够与莱茵衣藻中的rab20蛋白产生特异性结合，在红色荧光下能够观察到rab20定位于细胞基体和纤毛。
4.如权利要求1至3任一项所述的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
【专利技术属性】
技术研发人员：樊振川，魏妍，刘雁霞，李文娟，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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