本发明专利技术涉及聚酮化合物和其他天然产物的生产，并且涉及化合物文库和单个的新型化合物。因此，一方面，本发明专利技术提供了１７－去甲基雷帕霉素及其类似物，它们的生产方法，包括重组菌株，以及本发明专利技术的化合物的分离和用途。另一方面，本发明专利技术提供了１７－去甲基雷帕霉素及其类似物在诱导或维持免疫抑制，刺激神经元再生或治疗癌症、Ｂ－细胞恶性肿瘤、真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、炎性疾病、血管疾病和纤维变性疾病，和调控伤口愈合中的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及聚酮化合物和其他天然产物的生产，并且涉及化合物文库和单个的新型化合物。因此，一方面，本专利技术提供了17-去甲基雷帕霉素(17-demethylrapamycin)及其类似物，它们的生产方法，包括重组菌株，以及本专利技术的化合物的分离和用途。另一方面，本专利技术提供了这些新的17-去甲基雷帕霉素类似物在诱导或维持免疫抑制作用，刺激神经元再生或治疗癌症、B-细胞恶性肿瘤、真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、炎性疾病、血管疾病和纤维变性疾病，和调控伤口愈合中的用途。在具体实施方案中，本专利技术提供了用于控制雷帕霉素的生产的生物合成基因的工程化的方法，以便制备能产生17-去甲基雷帕霉素及其类似物的工程菌株。本专利技术还涉及通过将非天然启动酸(non-natural starter acid)供给所述菌株制备17-去甲基雷帕霉素类似物文库的方法，以及由此生产的化合物的文库，并涉及衍生菌株的产生，其中表达克隆的基因或基因盒，以便产生其他类似物，并且以便加工用于它们的制备，并且涉及其中所使用的工具(例如，核酸，载体，基因盒和遗传修饰菌株)。
技术介绍
雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))(图1)由吸湿链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)NRRL 5491生产的亲脂性大环内酯(Sehgal等，1975；Vezina等，1975；U.S.3,929,992；U.S.3,993,749)，其具有连接在六氢哌啶羧酸内酯(pipecolic acid lactone)上的1，2，3-三羰基部分(Paiva等，1991)。其他相关的大环内酯(图2)包括FK506(他克莫司(tacrolimus))(Schreiber and Crabtree，1992)，FK520(子囊霉素(ascomycin)或免疫霉素(immunomycin))(Wu等，2000)，FK525(Hatanaka H，等，1989)，FK523(Hatanaka，H.，等，1988)，antascomicins(Fehr，T.，等，1996)和meridamycin(Salituro等，1995)。对于本专利技术来说，雷帕霉素是首先通过McAlpine等(1991)的编号规定，然后通过Findlay等(1980)或化学文摘(Chemical Abstracts)(11th累积索引(Cumulative Index)，1982-1986p60719CS)的编号规定进行说明。雷帕霉素的聚酮化合物主链是通过一共七个丙酸和七个乙酸单元与莽草酸衍生的环己烷羧酸起始单元从头到尾稠合(heat-to-tail condensation)产生的(Paiva等，1991)。L-赖氨酸衍生的氨基酸，六氢吡啶羧酸通过酰胺键稠合在聚酮化合物主链的最后一个乙酸上(Paiva等，1993)，然后通过内酯化作用形成所述大环。已经对包括所述生物合成基因簇的107kb基因组区进行了测序(Schwecke等，1995)。分析所述开放读框发现了编码模块聚酮化合物合酶(PKS)的三个大基因(Aparicio等，1996；Schwecke等，1995)。包埋在PKS基因之间的是编码蛋白的rapP基因，所述蛋白与非核糖体肽合成酶的激活结构域具有序列相似性，并且被认为起着类似作用(Knig等，1997)。在编码PKS基因的区域的两侧有24个额外的开放读框，它们所编码的酶被认为是雷帕霉素生物合成所必需的(Molnar等，1996)。其中包括以下聚酮化合物后修饰酶两种细胞色素P-450单加氧酶，称为RapJ和RapN，和相关的铁氧化还原蛋白RapO，以及三种SAM-依赖型O-甲基转移酶RapI，RapM和RapQ。其他相邻的基因在雷帕霉素的调控和输出方面具有推定的作用(Molnar等，1996)。所述基因簇还包括基因rapL，它的产物RapL被认为能通过L-赖氨酸的环脱氨作用催化雷帕霉素前体L-甲基哌啶的形成(Khaw等，1998；Paiva等，1993)。雷帕霉素的聚酮化合物核心是通过非常大的，多功能蛋白组装的，包括I型聚酮化合物合酶(rap PKS)。该多肽复合物包括加载模块(loading module)和十四个延伸模块(extension module)，每一个模块负责将特异性酰基-CoA前体添加到生长中的聚酮化合物链上，并且负责β-酮羰基的还原程度。每一个模块进行若干种生物化学反应，这些反应是由所述多肽的特定的结构域执行的。所有延伸模块包括酰基转移酶(AT)结构域，它从前体上选择酰基并且将它提供给酰基载体蛋白(ACP)结构域，以及β-酮合酶(KS)结构域，其通过脱羧稠合作用将预先存在的聚酮化合物链添加到新的酰基-ACP上。在某些延伸模块上存在其他结构域β-酮还原酶(KR)结构域，它将β-酮基还原成羟基，脱水酶(DH)结构域，它作用于羟基以形成双键，以及烯酰还原酶(enoyl reductase)(ER)结构域，它还原双键以形成饱和的碳。可预测模块3和6中存在的β-酮加工结构域是无活性的，因为这些结构域的作用没有体现在最终结构上。最终的延伸模块(延伸模块14)似乎不包括任何β-酮-加工结构域。雷帕霉素生物合成的启动是通过4，5-二羟基环己-1-烯羧酸的并入(incorporation)进行的，后者是由莽草酸途径衍生的(Lowden，P.A.S.，等2001)，并且是其他FKBP-结合分子诸如FK506和FK520所共有的(common)(图2)。在聚酮化合物的生物合成之后，由rapP编码的NRPS模块结合了六氢吡啶羧酸(L-赖氨酸衍生的)，它通过酰胺键稠合在聚酮化合物主链的最后一个乙酸上(Paiva等，1993)。随后通过内酯化作用形成大环。三种雷帕霉素PKS基因、NRPS-编码基因和侧翼晚期基因(flanking lategene)序列的每一种的核苷酸序列以及相应的多肽在Aparicio等，1996，和Schwecke等，1995中鉴定，并且由NCBI以保藏号X86780保藏，对该序列的修正最近已经在WO 04/007709中公开。雷帕霉素生物合成基因簇的第一种无酶产物已经被命名为前-雷帕霉素(WO 04/007709，Gregory等，2004)。全面加工过的雷帕霉素的生产需要通过由雷帕霉素晚期基因所编码的酶，RapJ，RapN，RapO，RapM，RapQ和RapI对聚酮化合物/NRPS核心进行额外加工。雷帕霉素具有重要的药理学价值，因为该化合物表现出宽的活性光谱；这强调了制备所述药物的新型类似物的必要性。雷帕霉素表现出中等抗真菌活性，主要是抗念珠菌属(Candida)的菌种，不过还能抗丝状真菌(Baker等，1978；Sehgal等，1975；Vezina等，1975；U.S.3,929,992；U.S.3,993,749)。雷帕霉素通过靶向多种细胞类型中的信号传导途径，例如，通过抑制使细胞周期从G1期发展到S-期的信号传导途径来抑制细胞增殖(Kuo等，1992)。在T细胞中，雷帕霉素抑制来自IL-2受体的信号传导和随后的导致免疫抑制的T细胞自发增殖。雷帕霉素的抑制作用并不局限于T细胞，因为雷帕霉素能抑制多种哺乳动物细胞类型的增殖(本文档来自技高网...
【技术保护点】
１７－去甲基雷帕霉素及其类似物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：马修A格雷戈里，克里斯蒂娜J马丁，
申请(专利权)人：比奥蒂卡科技有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]
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