灵长类胚胎干细胞的培养制造技术

本发明专利技术涉及培养人胚胎干细胞的方法，该方法是在基本不含哺乳动物胎儿血清的环境中和在干细胞培养基中培养干细胞，所述干细胞培养基含有氨基酸、维生素、盐、矿物质、运铁蛋白、胰岛素、白蛋白并添加有不止是饲养层来源的成纤维细胞生长因子。还公开了能够支持人胚胎干细胞的培养和增殖但不需要饲养细胞或者使培养基接触饲养细胞的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】关于联邦政府资助研究的声明待定。
技术介绍
本专利技术涉及培养灵长类胚胎干细胞培养物的方法以及与其一起使用的培养基。已经从着床前胚胎获得了灵长类(例如，猴和人)多能胚胎干细胞。参见，例如，美国专利5,843,780和J.Thomson等，282 Science 1145-1147(1998)。这些公开的内容以及这里提及的所有其它公开通过引入纳入本文，这就如同已经在文中全文列出。尽管延长了培养时间，但这些细胞稳定保持形成所有三个胚层的高级衍生物的发育潜能。灵长类(尤其是人类)ES细胞系被广泛用于人类发育生物学、药物发现、药物测试和移植药物。例如，目前对着床后人胚胎的了解主要是基于数量有限的静态组织切片。由于伦理原因，实质上还未研究控制早期人胚胎发育决定的根本机制。尽管实验哺乳动物发育生物学主要依赖于小鼠，且尽管有许多控制发育的基本机制在小鼠和人之间是保守的，但小鼠和人的早期发育之间有显著区别。因此需要灵长类/人ES细胞以深入了解它们的分化和功能。灵长类ES细胞的分化衍生物可用来鉴定新药的基因靶点、用来测试新化合物的毒性或致畸性、以及用于移植以替代疾病部位的细胞群。通过移植ES细胞衍生细胞有可能治疗的疾病包括帕金森病、心脏梗塞、青少年糖尿病和白血病。参见，例如，J.Rossant等，17 Nature Biotechnology 23-4(1999)和J.Gearhart，282 Science 1061-2(1998)。长期增殖能力、长期培养后的发育潜能以及核型稳定性是利用灵长类胚胎干细胞培养物的关键特征。这种细胞的培养物(尤其是在成纤维细胞饲养层上的)通常补充有动物血清(尤其是胎牛血清)以在这种培养期间进行所需的增殖。例如，在美国专利5,453,357、5,670,372和5,690,296中公开了各种培养条件，其中包括使用一类碱性成纤维细胞生长因子和动物血清的一些条件。不幸的是，各批次血清的特性都有所不同，因此会影响培养物的特征。WO 98/30679讨论了用无血清补充物来代替动物血清支持培养物中的某些胚胎干细胞生长。该血清替代品中含有白蛋白或白蛋白替代物、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种运铁蛋白或运铁蛋白替代物、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代物、一种或多种胶原前体以及一种或多种痕量元素。注意，这种替代品中还可补充白血病抑制因子、青灰因子或睫状节神经细胞营养因子。不幸的是，对于灵长类胚胎干细胞培养物(尤其是生长在成纤维细胞饲养层上的那些细胞)，这些培养基不令人满意。对于营养血清培养基(例如，胎牛血清)，WO 99/20741讨论了在培养灵长类干细胞时使用各种生长因子(如bFGF)的益处。然而其中未描述不含营养血清的培养基。美国专利5,405,772描述了造血细胞和骨髓基质细胞的生长培养基。其中提到，在缺乏血清的培养基中使用成纤维细胞生长因子以用于该目的。然而其中未描述灵长类胚胎干细胞的生长条件。首先用成纤维细胞饲养细胞层培养人胚胎干细胞培养物，这种饲养细胞层能够使人胚胎干细胞增殖同时保持未分化状态。然后发现，使培养基接触饲养细胞足以形成所谓的调节培养基(conditioned medium)，这种培养基具有与直接使用饲养细胞相同的特性。不使用饲养细胞或调节培养基，培养的人胚胎干细胞就不能保持未分化状态。由于使用了饲养细胞，或者即便是使培养基接触饲养细胞，培养物都有被不需要的物质污染的风险，因此最好避免使用饲养细胞和调节培养基。未曾接触过饲养细胞的培养基在这里被称为非调节培养基(unconditioned medium)。因此可以看出，仍旧需要在不使用动物血清时稳定培养灵长类胚胎干细胞的技术。专利技术概述在本专利技术的一个方面提供了培养灵长类胚胎干细胞的方法。一种方法是在基本不含哺乳动物胎儿血清(也优选基本不含任何动物血清)并在含有不止是成纤维细胞饲养层来源的成纤维细胞生长因子的培养物中培养干细胞。在优选的形式中，通过加入足量成纤维细胞生长因子就不再需要之前维持干细胞培养物所必需的成纤维细胞饲养层。成纤维细胞生长因子是哺乳动物发育所必需的分子。目前有20多种已知的成纤维细胞生长因子配体和5种上述配体的成纤维细胞生长因子信号转导受体(以及它们的剪接变体)。通常可参见D.Ornitz等，25 J.Biol.Chem.15292-7(1996)；美国专利5,453,357。预计这些因子在物种之间有微小变化，因此术语成纤维细胞生长因子不受物种限制。然而，我们优选使用人成纤维细胞生长因子，更优选由重组基因产生的人碱性成纤维细胞生长因子。这种化合物不难从Gibco BRL-Life Technologies以及其它公司大量购得。注意，出于本专利技术的目的，尽管已经从血清分离出单独的组分(例如，牛血清白蛋白)且随后外源性提供这些组分，所述培养物仍可基本不含特定的血清。关键是，加入血清本身就增加了变数。然而，当加入这种血清中的一种或多种良好定义的纯化组分时则不会这样。优选的，用这种方法培养的灵长类胚胎干细胞是真ES细胞系的人胚胎干细胞，它们(i)能够在体外以未分化状态无限增殖；(ii)即便在长期培养后也能够分化成所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物；和(iii)在长期培养中维持正常核型(整倍体)。因此这些细胞被称为多能细胞。这种培养能够使胚胎干细胞在培养物中稳定增殖1个月以上(优选6个月以上；更优选12个月以上)同时维持干细胞分化成内胚层、中胚层和外胚层组织衍生物的潜能，同时维持干细胞的核型。在本专利技术的另一方面，提供了另一种培养灵长类胚胎干细胞的方法。一种方法是在基本不含哺乳动物胎儿血清(也优选基本不含任何动物血清)并在含有能够激活成纤维细胞生长因子信号转导受体的生长因子的培养物中培养干细胞，其中所述生长因子的来源不止是成纤维细胞饲养层。虽然生长因子优选是成纤维细胞生长因子，但也可以是其它物质，如设计用来激活成纤维细胞生长因子受体的某些合成的小肽(例如，由重组DNA变体或突变体产生的)。通常可参见T.Yamaguchi等，152 Dev.Biol.75-88(1992)(信号转导受体)。在本专利技术的又一方面，提供了培养灵长类胚胎干细胞的培养系统。其中具有不止是成纤维细胞饲养层来源的人碱性成纤维细胞生长因子。该培养系统基本不含动物血清。本专利技术的再一方面提供了用上述方法衍生的细胞系(优选克隆细胞系)。“衍生的”以其广义含义使用，包括直接和间接衍生的细胞系。因此可以避免由于各批次动物血清之间的差异而导致的变化。此外，还发现，在使用成纤维细胞生长因子时避免使用动物血清能够提高克隆率。因此，本专利技术的一个优点是提供灵长类胚胎干细胞系的培养条件，该条件的可变性较低并能够更加有效地克隆。通过研究说明书和权利要求书将了解本专利技术的其它优点。优选实施方案的详细描述在以下一些实验中，专利技术人之一在这里使用本专利技术的方法和培养系统来培养人ES细胞系，而未在培养基中加入血清。在不含血清成分的培养基中培养时，两个克隆衍生的人ES细胞系在克隆衍生后增殖8个月以上，并且维持了分化成所有三个胚层的高级衍生物的能力。在下述另一实验中，现在已经证实，即便在不含血清和饲养细胞时，加入相对大量的人成纤维细胞生长因子(FGF)也有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养人胚胎干细胞的方法，所述方法包括：　　　　在基本不含哺乳动物胎血清的培养物中和在含有氨基酸、维生素、盐、矿物质、运铁蛋白或运铁蛋白替代物、胰岛素或胰岛素替代物、白蛋白以及成纤维细胞生长因子的干细胞培养基中培养干细胞，所添加的成纤维细胞生长因子来自除饲养层之外的来源，其浓度至少与维持浓度一样高，所述培养基能够支持培养和增殖人未分化的增殖整倍体胚胎干细胞至少６代，不需要饲养细胞或者使培养基接触饲养细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：JA托马森，M莱文斯坦，
申请(专利权)人：威塞尔研究所股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]