无饲养细胞的胚胎干细胞的长期培养物制造技术

以前培养人胚胎干细胞的方法需要成纤维细胞饲养细胞或曾经接触成纤维细胞饲养细胞的培养基以将干细胞维持在未分化状态。现在发现，如果在培养干细胞的培养基中加入骨形态发生蛋白拮抗剂和成纤维细胞生长因子，即便没有饲养细胞或调理培养基，干细胞也将无限期地维持未分化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】无饲养细胞的胚胎干细胞的长期培养物相关申请的交叉参考本申请要求2004年5月21日提交的美国临时专利申请序列号60/573,545的优先权。关于联邦政府资助研究或开发的声明待定。专利技术背景干细胞被定义为能够分化成许多其它分化细胞类型的细胞。胚胎干细胞是来自胚胎的干细胞，能够分化成大多数，如果不是全部，成熟机体的分化细胞类型。干细胞被称为是多能的，这是指它能够分化成许多细胞类型。一类受到研究机构高度关注的多能干细胞是人胚胎干细胞，这里简称为hES细胞，这是一种来自人胚胎来源的胚胎干细胞。人胚胎干细胞由于能够在培养基中无限增殖并由此而能够(至少原则上能够)提供细胞和组织以替代缺陷或受损的人组织而受到极大科学关注。培养物中存在人胚胎干细胞有可能提供无限量的人细胞和组织以用于各种有助于人体健康的治疗方案。可以想像，在未来，将能够增殖人胚胎干细胞并使其定向分化成特定谱系以产生出于治疗目的可移植入人体的分化的细胞或组织。人胚胎干细胞一个最重要的特征是能够自我更新。这就意味着hES细胞能够增殖成多种后代干细胞，其中每种似乎都具有其祖先细胞的全部潜能。换句话说，后代被更新而具有亲本细胞的所有发育和增殖能力。这种特性以及多能性使得hES细胞可用于多种潜在用途，因为，从理论上说，hES细胞能够无限大量复制且然后可诱导成为人体内的任何细胞类型。根据已有知识而言，只有未分化的hES细胞才能够无限自我更新，一旦细胞分化就丧失了自我更新的能力，至少从这一角度看，能够自我更新的特性似乎与保持未分化的特性密切相关。由于人胚胎干细胞将自发分化，因此培养时必需小心以维持细胞处于未分化状态。已经描述了产生和培养人胚胎干细胞以维持细胞处于未分化状态的基础技术。现有技术的确有效，但一些目前用来培养人胚胎干细胞的方法有限制和缺点。一种限制意义特别重大。大多数现有人胚胎干细胞系在一定程度上或在其它程度上已经直接暴露于小鼠细胞或暴露于其中已经培养过小鼠细胞的培养基。最初的产生和培养人胚胎干细胞的技术要使用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞作为饲养层，在该饲养层上可培养人胚胎干细胞。成纤维细胞饲养层通过一些仍不十分清除的机制使得干细胞能够保持在未分化状态。随后发现，如果使干细胞接触“调理培养基(conditionedmedium)”也能获得相同的现象。调理培养基无非就是已经培养过MEF等饲养细胞的干细胞培养基。无论饲养细胞是能赋予培养基某些因子还是能从培养基中除去某些因子，其结果都是调理培养基可用来培养干细胞使其不发生分化。无论是培养条件、直接在饲养细胞上生长还是使用调理培养基都涉及一种或多种能从小鼠细胞传递到人ES细胞的试剂，如病毒。如果培养人胚胎干细胞的一个目的是产生最终可植入人体的组织，就高度需要干细胞从而暴露于其它种类的细胞或者暴露于曾用来培养其它种类细胞的培养基。同时，使用任何种类的饲养细胞会在培养干细胞时带来不需要的生物变异，而这是要尽可能避免的。因此，在利用人胚胎干细胞技术的持续发展中最感兴趣的是找到能增殖和培养人胚胎干细胞但不含成纤维细胞饲养层且不含调理培养基的培养条件。一些培养基配方能够在一段时间内使人ES细胞维持未分化状态，但长期培养时将不能维持这种状态。具体地说，我们定义来自最初的种子培养物的人ES细胞在培养板上生长至细胞铺满一个“传代”。我们发现一些培养基配方允许培养人ES细胞一或两个传代不发生严重分化，但在随后的传代中细胞逐渐或迅速分化。我们已经开始相信，为得到确实能够支持人ES细胞无限增殖而不分化且不含饲养细胞或饲养细胞调理的培养基的培养基，培养基必需支持培养人ES细胞处于基本均匀且未分化状态至少5代。专利技术概述本专利技术可概述为一种不需任何类型的饲养细胞或调理培养基的培养人胚胎干细胞的方法，该方法包括在含有足以维持干细胞处于未分化状态量的盐、维生素、氨基酸、葡萄糖、成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白拮抗剂的培养基中培养人胚胎干细胞的步骤。本专利技术还涉及培养在含有骨形态发生蛋白拮抗剂、因此无需成纤维细胞饲养细胞或调理培养基就可无限培养干细胞使其处于未分化状态的培养基中的人胚胎干细胞的体外细胞培养物。本专利技术的一个目的是定义一种不使用饲养细胞的人胚胎干细胞的长期培养条件，包括不在饲养细胞上培养和不在饲养细胞调理过的培养基上培养。本专利技术的另一个目的是定义一种尽可能确定的(defined)的同时完全不依赖于饲养细胞的人胚胎干细胞的培养条件。通过以下描述将了解本专利技术的其它目的、特征和优点。附图简述无。专利技术详述对先前人胚胎干(ES)细胞培养物只有在存在成纤维细胞饲养细胞时或在调理培养基中培养才能维持在未分化状态的观察，引起了成纤维细胞在培养基中释放了能够抑制ES细胞分化的因子的推测。这种推测还基于对鼠ES细胞系的平行观察，当鼠ES细胞系与成纤维细胞饲养细胞一起培养时会对成纤维细胞分泌的白血病抑制因子(LIF)响应而维持未分化。LIF能够激活鼠ES细胞中引发自我更新的信号途径。然而，人ES细胞不对LIF产生响应，其细胞表面实际上似乎不具有LIF受体。由于未从调理培养基中分离出似乎能阻止人ES细胞分化的单个因子，我们建立了一种新的假说。我们假设，成纤维细胞使非调理培养基中存在的分化因子失活。各研究小组已经研究了启动人ES细胞分化成富含一种或多种特定谱系细胞的后代细胞培养物的因子。这些分化因子之一是已知为骨形态发生蛋白(BMP)的蛋白质因子类别。BMP是分泌型信号分子转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员。它们在胚胎发育的几乎所有方面都发挥广泛作用。BMP4和BMP家族其它成员如BMP2、-5和-7结合II型BMP受体BRII，该受体能召集(recruit)I型受体BR1A(ALK3)或BR1B。配体激活后，I型受体的胞内激酶结构域磷酸化Smad1、-5和-8，它们然后在Smad的保护下进入细胞核并活化靶基因。细胞内BMP、受体和Smad的相对表达水平是BMP诱导的应答的重要决定因素。其它信号转导途径的共刺激也能改变BMP效应的特性。一个典型的例子是共激活小鼠ES细胞中的LIF信号引起的BMP的作用的变化：单独的BMP信号能诱导非神经上皮分化，而BMP和LIF信号一起能抑制分化成任何谱系。胞外BMP拮抗剂如头蛋白、gremlin(格勒姆林素)、脊索发生素、抑制素、促滤泡素抑制素、扭型原肠胚形成(twistedgastrulation)和DAN家族的成员等可修饰、减弱BMP活性或使其完全无效。另一方面，一些信号传导途径可打断胞内BMP信号传导。例如，成纤维细胞生长因子(FGF)激活的MAPK信号传导可通过磷酸化Smad的接头结构域而阻止Smad发生核转运从而抑制BMP信号传导。转化生长因子β(TGFβ)、Nodal或活化素(Activin)信号传导途径的活化可通过胞内通讯如与Smad4竞争进入细胞核而拮抗BMP信号传导。预计所有这些分子都可用来拮抗BMP信号传导以获得这里所述的效应。还观察到骨形态发生蛋白(BMP)刺激的胞内信号的水平在生长在调理培养基中的人ES细胞中较低，而同种信号的水平在生长在非调理培养基(且不含成纤维细胞饲养细胞)中的人ES细胞中较高。调节培养基产生的效应可能是由于抑制了非调理培养基中存在的BMP诱导信号的作用的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在不依赖于饲养细胞的培养物中培养人胚胎干细胞的方法，所述方法包括在含有足以维持干细胞处于未分化状态量的盐、维生素、氨基酸、葡萄糖、成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白拮抗剂的培养基中培养人胚胎干细胞的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2004-5-21 60/573,5451.一种在不依赖于饲养细胞的培养物中培养人胚胎干细胞并维持所述人胚胎干细胞处于未分化状态的方法，所述方法包括在含有盐、维生素、氨基酸、葡萄糖、成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白拮抗剂的培养基中培养人胚胎干细胞的步骤，所述人胚胎干细胞来自已建立人胚胎干细胞系，所述已建立人胚胎干细胞系选自人胚胎干细胞系H1，H9和H14；其中，所述骨形态发生蛋白拮抗剂选自下组：头蛋白、格勒姆林素、脊索发生素、促滤泡素抑制素、扭型原肠胚形成、DAN家族的成员和特异于骨形态发生蛋白的拮抗剂抗体；且其中，所述成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白拮抗剂以足以维持所述人胚胎干细胞处于未分化状态的量提供。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基含有浓度至少为4ng/ml的成纤维细胞生长因子。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述骨形态发生蛋白拮抗剂是头蛋白。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述成纤维细胞生长因子是bFGF，其浓度为40ng/ml。5.如权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐仁和，JA汤姆森，
申请(专利权)人：威塞尔研究所股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]