采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法技术

本发明专利技术是一种生物技术领域的用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法。本发明专利技术将转基因青蒿外植体经过消毒后，置于微不定芽诱导培养基上，光照培养，在外植体周围长出大量微不定芽；将长有大量微不定芽的外植体转移到微不定芽伸长培养基中，使微不定芽伸长；切取伸长后的不定芽转移到不定芽生根培养基上，产生出不定根；将生长健壮的完整植株移栽到盛有移栽基质的花盆中，通过驯化获得大量生长正常的转基因青蒿植株。本发明专利技术筛选出适合转基因青蒿微不定芽诱导和生根的培养基，转基因青蒿外植体微不定芽诱导率超过９０％，不定芽生根率为１００％，再生植株移栽存活率为１００％，繁殖系数达到８０－１００。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种生物
的方法，具体是一种采用微不定芽技术快速繁殖 转基因青蒿的方法。
技术介绍
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemi是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的 最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另 外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗 血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能，可见青蒿素是一种多用途的天然药物。目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非 常低(0.01%-1%),使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复 杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。另外，青蒿素在愈伤组织中含 量低于干重的0. 1%，在芽中最高也只有干重的0. 16%，而大多数研究者在根中没有检测 到青蒿素，因此利用组织培养及细胞工程生产青蒿素的可行性也不高。随着青蒿素生物合成途径研究的逐渐深入以及植物次生代谢工程的不断发展，利用 转基因技术提高青蒿中青蒿素的含量是一种颇具前景的方法。目前，已有青蒿素含量较 高的转基因青蒿。然而，转基因青蒿一般为杂合体，不具备遗传稳定性，后代中基因发 生分离，不利于农业生产。从转基因青蒿培育纯系品种需要很长的时间，而且耗费大量 的人力物力，这使得转基因青蒿的大面积推广受到了一定的限制。经对现有技术的査新，现有文献中目前已有多种植物通过微不定芽技术快速繁殖成 完整再生植株的报道。如果能通过微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿，将对保持转基因 青蒿的遗传稳定性，对转基因青蒿的大面积推广、保障充足优质的青蒿种苗、提高青蒿 素产量具有重要意义。目前尚未发现与本专利技术主题所提及的采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种采用微不定芽技术快速繁殖转 基因青蒿的方法。本专利技术中涉及的青蒿微不定芽诱导培养基、微不定芽伸长培养基、不 定芽生根培养基和移栽基质用于本专利技术微不定芽组织培养的方法，建立了用微不定芽技 术快速繁殖转基因青蒿的方法，能够在短时间内繁殖出大量的转基因青蒿苗，为转基因 青蒿的大面积推广、保障充足优质的青蒿种苗、提高青蒿素产量奠定了坚实的基础。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术将转基因青蒿外植体经过消毒后，置于 微不定芽诱导培养基上，经光照培养，在外植体周围长出大量微不定芽；将长有大量微 不定芽的外植体转移到微不定芽伸长培养基上，使微不定芽伸长；切取伸长后的不定芽 转移到不定芽生根培养基上，产生出不定根；将生长健壮的完整植株移栽到盛有移栽基 质的花盆中，通过驯化获得生长正常的转基因青蒿植株。所述转基因青蒿外植体的消毒，是指从转基因青蒿植株上剪取外植体，用75%酒 精消毒20秒，无菌水清洗l遍，1.5% HgCl2消毒6分钟，无菌水清洗5-6遍。所述外植体为含有生长点的幼嫩茎段，长lcm-2cm。所述微不定芽诱导培养基，是通过在MS培养基中添加0.5 mg/L 6-苄基腺嘌呤 (6-BA)、 0.05 mg/L萘乙酸(NAA)、 30g/L蔗糖和6. 5g/L琼脂粉而得。其中MS培养 基为Murashige and Skoog于1962公布。所述经光照培养，在外植体周围长出大量微不定芽，是指培养温度为25士rc， 每天光照16小时，每14-20天继代培养一次，经过1-2次继代培养后在外植体周围长 出大量微不定芽。所述微不定芽伸长培养基为MS培养基，其中添加30g/L蔗糖和6. 5g/L琼脂粉。所述使微不定芽伸长，是指培养温度为25'C土rC，每天光照16小时，经过14 天-20天使微不定芽伸长。所述不定芽生根培养基为1/2 MS培养基(即MS培养基用量的一半)，其中添加30g/L 蔗糖和6. 5g/L琼脂粉。所述产生出不定根，是指培养温度为25土rC，每天光照16小时，经过7天-14 天可产生出不定根，从而形成完整的青蒿植株。所述将生长健壮的完整植株移栽到盛有移栽基质的花盆中，是指选取生长健壮的植株，移栽到装有移栽基质的穴盘中。所述移栽基质为珍珠岩泥炭，珍珠岩和泥炭的体积比为1: 1。本专利技术采用微不定芽组织培养的方法，筛选出适合转基因青蒿微不定芽诱导和生根 的培养基，转基因青蒿外植体微不定芽诱导率超过90%，不定芽生根率为100%，再生植株移栽存活率为100%，繁殖系数达到80-100，转基因青蒿微不定芽快速繁殖技术的建立，为快速繁殖出大量的转基因青蒿苗，对转基因青蒿的大面积推广、保障充足优质的 青蒿种苗、提高青蒿素产量具有重要意义。 具体实施例方式下面对本专利技术的实施例作详细说明:本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实 施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施 例。实施例1转基因青蒿外植体的消毒和微不定芽的诱导从转基因青蒿植株上剪取含有生长点的幼嫩茎段(1 cm长)作为外植体。用75% 酒精消毒20秒，无菌水清洗1遍，1. 5% HgCl2消毒6分钟，无菌水清洗5遍。将消毒 后的转基因青蒿外植体转移到微不定芽诱导培养基上，所述微不定芽诱导培养基为MS 培养基+0.5 mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA) +0.05 mg/L萘乙酸(NM) +3%蔗糖+0. 65%琼 脂粉。培养温度为25士rC，每天光照16小时，每14天继代培养一次，经过l次继代 培养后在外植体周围长出大量微不定芽(长度为1.5 cm)。微不定芽诱导率达到91%。转基因青蒿微不定芽的伸长和生根将长有大量微不定芽的外植体转移到微不定芽伸长培养基上，所述微不定芽伸长培 养基为MS培养基+3%蔗糖+0. 65%琼脂粉。培养温度为25士rC，每天光照16小时，经 过20天可使微不定芽伸长至5cm。切取伸长后的不定芽转移到不定芽生根培养基上， 所述不定芽生根培养基为1/2 MS培养基+3y。蔗糖+0.65。/。琼脂粉。培养温度为25土rC， 每天光照16小时，经过10天可产生出不定根，不定根的分化率为100%，从而形成完 整的青蒿植株。转基因青蒿再生植株的移栽选取生长健壮的植株，洗去根部的培养基，移栽到装有移栽基质的穴盘中，所述移 栽基质中的成分为珍珠岩和泥炭，其比例为1: 1。通过驯化1周，可获得大量生长正常的转基因青蒿植株，移栽存活率为100%。繁殖系数达到80。 实施例2转基因青蒿外植体的消毒和微不定芽的诱导从转基因青蒿植株上剪取含有生长点的幼嫩茎段(1.5cm长)作为外植体。用75% 酒精消毒20秒，无菌水清洗l遍，1.5% HgCl2消毒6分钟，无菌水清洗5遍。将消毒 后的转基因青蒿外植体转移到微不定芽诱导培养基上，所述微不定芽诱导培养基为MS 培养基+0.5 mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA) +0.05 mg/L萘乙酸(NAA) +3%蔗糖+0. 65%琼 脂粉。培养温度为25士rC，每天光照16小时，每14天继代培养一次，经过l次继代 培养后在外植体周围长出大量微不定芽(长度为1.5 cm)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用微不定芽技术快速繁殖转基因青蒿的方法，其特征在于，将转基因青蒿外植体经过消毒后，置于微不定芽诱导培养基上，经光照培养，在外植体周围长出大量微不定芽，将长有大量微不定芽的外植体转移到微不定芽伸长培养基上，使微不定芽伸长，切取伸长后的不定芽转移到不定芽生根培养基上，产生出不定根，将生长健壮的完整植株移栽到盛有移栽基质的花盆中，通过驯化获得生长正常的转基因青蒿植株；　　　　所述微不定芽诱导培养基为ＭＳ培养基，其中添加０．５ｍｇ／Ｌ　　６－苄基腺嘌呤、０．０５ｍｇ／Ｌ萘乙酸、３０ｇ／Ｌ蔗糖和６．５ｇ／Ｌ琼脂粉；　　　　所述微不定芽伸长培养基为ＭＳ培养基，其中添加３０ｇ／Ｌ蔗糖和６．５ｇ／Ｌ琼脂粉；　　　　所述不定芽生根培养基为１／２　　ＭＳ培养基，其中添加３０ｇ／Ｌ蔗糖和６．５ｇ／Ｌ琼脂粉；　　　　所述移栽基质为珍珠岩∶泥炭，珍珠岩和泥炭的体积比为１∶１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，张凌，景福远，王国丰，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]