运动场用结缕草组织培养快速繁殖的方法技术

本发明专利技术公开了一种运动场用结缕草组织培养快速繁殖的方法，属于生物技术领域。本方法包括下列步骤：①外植体选取与消毒；②改良培养基的配备；③愈伤诱导；④愈伤继代；⑤芽分化；⑥生根培养；⑦炼苗与移栽。对MS培养基进行改良，配方为：在基础的MS培养基中加入pvp40和酸水解酪蛋白，其他组分均无变化；pvp‑40的浓度为0.1‑1mg/L，酸水解酪蛋白浓度为0.15‑0.5mg/L。利用本发明专利技术所述的培养基配方和利用种子作为外植体，首次建立了结缕草Compadre组织培养体系；从种子诱导愈伤到获得体外植株，总周期为135天；以此为利用遗传转化技术来解决结缕草绿期短的问题奠定了基础，更好地推动了运动场草坪事业的发展。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种运动场用结缕草组织培养快速繁殖的方法。
技术介绍
结缕草(ZoysiajaponicaSteud)属于禾本科，是一种多年生的暖季型草坪草，其具有抗旱、抗病和耐粗放管理等优良的特点；在暖季型草坪草中抗寒性最强，由于其具有很强的耐践踏能力及其恢复能力强的特点，被广泛应用于运动场草坪。但与冷季型草坪草比较，他的绿期相对较短，在改进其绿期方面，利用传统的育种手段已经无法从根本上解决此问题；随着分子育种技术的发展，利用遗传转化技术为解决此问题提供了可能；一个高效的组织培养体系是遗传转化体系的核心，而组织培养体系受到物种的基因型限制，不同的基因型品种对结缕草的组织培养体系具有很大的影响。本专利技术使用的是结缕草Compadre品种，此品种是从美国HANCOCK种子公司引种而来的优质草种，目前在国内得到很好的适应，但目前尚未有关Compadre组织培养体系建立的报道。目前已有一些有关结缕草其它品种的组织培养体系的报道，1989年，Al-Khayri等人利用种子作为外植体，首次建立了结缕草组织培养体系，Asano1989；Asanoetal.1996；Poeaimetal.2004；XunWangetal.2010等利用不同结缕草品种建立了组织培养体系，但有一点是公认的，不同的基因型结缕草品种的组织培养体系的配方，生长周期、愈伤诱导率和再生率存在很大的区别。Compadre作为一种优质的品种，具有优质的色泽、抗旱、抗病和耐粗放管理等优良特性，在美国的运动场已经得到广泛的应用；自2009年引种到国内，在北京地区也得到良好的适应；但其也具备结缕草普遍具有的缺陷，就是绿期相对较短，目前结缕草Compadre缺乏一套高效的组织培养体系，本专利技术以此为目的，以此为利用遗传转化技术解决结缕草Compadre绿期短的问题奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种运动场用结缕草组织培养快速繁殖的方法。本专利技术采用的技术方案如下：通过种子无菌处理，愈伤诱导，芽的分化，生根的培养和植物生长调节剂的选择，探索结缕草Compadre在组织培养过程的各种条件，首次建立了结缕草Compadre的组织培养体系，为利用遗传转化技术改良结缕草Compadre奠定基础。具体地说，本方法包括以下步骤：①外植体选取与消毒；②改良培养基的配备；③愈伤诱导；④愈伤继代；⑤芽分化；⑥生根培养；⑦炼苗与移栽；对培养基的改良方法如下：对MS培养基进行改良，配方为：在基础的MS培养基中加入pvp40和酸水解酪蛋白，其他组分均无变化；pvp-40的浓度为0.1-1mg/L，酸水解酪蛋白浓度为0.15-0.5mg/L；配备用于愈伤诱导的培养基，配方为：在改良的MS培养基的基础上添2,4-D、6-BA、维生素B1和α-酮戊二酸；其中2,4-D的浓度为1-8mg/L，6-BA的浓度为0.1-1mg/L，维生素B1的浓度为1-10mg/L，α-酮戊二酸的浓度为50-600mg/L；配备用于愈伤继代的培养基，配方为：在改良的MS培养基的基础上添加2,4-D、6-BA、TDZ、维生素B1和α-酮戊二酸；其中2,4-D的浓度为1-8mg/L，6-BA的浓度为0.1-1mg/L，TDZ的浓度为0.01-0.1mg/L，维生素B1的浓度为1-10mg/L，α-酮戊二酸的浓度为50-600mg/L；配备芽分化的培养基，配方为：在改良的MS培养基的基础上添加TDZ、NAA、GA和麦芽糖；其中TDZ的浓度为0.5-3mg/L，NAA的浓度为0.01-0.4mg/L，GA的浓度为0.05-0.5mg/L，麦芽糖的浓度20-40mg/L；配备生根培养基，配方为：将改良的MS培养基营养元素减半，再添加蔗糖和琼脂；其中蔗糖的浓度为10-30mg/L，琼脂的浓度为8-12mg/L；所有阶段的培养环境为：光照为40-80μE/m2/s，温度为26-28℃，培养基的pH为5.6-6.0。本专利技术具有下列优点和积极效果：①利用本专利技术所述的培养基配方和利用种子作为外植体，首次建立了结缕草Compadre组织培养体系，其中愈伤诱导率为75.2％，胚性愈伤率为60.2％，芽的分化率为58.3％，生根率为95.3％，组培苗移入土中成活率为98.3％；②从种子诱导愈伤到获得体外植株，总周期为135天，高效建立了利用组织培养的方法来实现结缕草Compadre快速繁殖的体系，其中大部分指标均高于其他同类结缕草品种；③以此为利用遗传转化技术来解决结缕草绿期短的问题奠定了基础，更好地推动了运动场草坪事业的发展。附图说明图1是本方法的流程图。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步详细的阐述，但本专利技术的实施方式并不局限于实施例表示的范围。一、优选1、改良的MS培养基中的pvp40为0.5mg/L，酸水解酪蛋白为0.25mg/L；2、所述用于愈伤诱导培养基2,4-D的浓度为5mg/L，6-BA的浓度为0.2mg/L，维生素B1的浓度为5mg/L，α-酮戊二酸的浓度为120mg/L；3、所述用于愈伤继代培养基2,4-D的浓度为5mg/L，6-BA的浓度为0.2mg/L,TD的浓度为0.05mg/L，维生素B1的浓度为5mg/L，α-酮戊二酸的浓度为120mg/L；4、在所述用于芽分化培养基中，TDZ的浓度为1.2mg/L，NAA的浓度为0.05mg/L，GA的浓度为0.1mg/L，麦芽糖的浓度为30mg/L；5、在所述用于生根培养基中，1/2MS营养元素更适合生根，蔗糖的浓度为10mg/L，琼脂的浓度为9g/L；6、在所述用于结缕草Compadre最适合的组织培养条件为，光照为60μE/m2/s，温度为28℃，pH为5.8。二、实施例1、实施例1本方法包括以下步骤：①外植体挑选与灭菌A、选取子粒饱满的结缕草Compadre种子作为外植体；B、用70％酒精灭菌2min，先对种子进行表面消毒，消毒完用蒸馏水清洗3次；C、用40％的次氯酸钠(有效Cl为10％)灭菌45min，加入0.1mL吐温20，并放在磁力搅拌器上进行搅拌，时间到后，在超净工作台上用500mL的无菌水进行清洗，再加入50mL无菌水放入4℃冰箱中低温春化24h；D、在超净工作台上将春化过的种子放在无菌滤纸上吹干；②对基础MS培养基进行改良在基础的MS培养基中加入pvp40和酸水解酪蛋白，其中pvp40浓度为0.2mg/L，酸水解酪蛋白的浓度为0.15mg/L，其他成分不变；③愈伤诱导将步骤①中灭菌的种子，播种到愈伤诱导培养基中，大约50颗/皿，用锡纸包裹，放置在温度为28±1℃条件下进行暗培养，培养20-23天，有愈伤长出；所述用于愈伤诱导培养基的配方为：在改良的MS培养基的基础上添加2,4-D、6-BA、维生素B1和α-酮戊二酸；其中2,4-D的浓度为2mg/L,6-BA的浓度为0.1mg/L，维生素B1的浓度为2mg/L，α-酮戊二酸的浓度为50mg/L，除以上另外加入蔗糖的量为30g/L，植物凝胶为3g/L，培养基的pH为5.6；④愈伤继代培养将步骤③培养30-35天诱导出来的愈伤进行拔本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种运动场用结缕草组织培养快速繁殖的方法，其特征在于包括下列步骤：①外植体选取与消毒；②改良培养基的配备；③愈伤诱导；④愈伤继代；⑤芽分化；⑥生根培养；⑦炼苗与移栽；对培养基的改良方法如下：对MS培养基进行改良，配方为：在基础的MS培养基中加入pvp40和酸水解酪蛋白，其他组分均无变化；pvp‑40的浓度为0.1‑1mg/L，酸水解酪蛋白浓度为0.15‑0.5mg/L；配备用于愈伤诱导的培养基，配方为：在改良的MS培养基的基础上添2,4‑D、6‑BA、维生素B1和α‑酮戊二酸；其中2,4‑D的浓度为1‑8mg/L，6‑BA的浓度为0.1‑1mg/L，维生素B1的浓度为1‑10mg/L，α‑酮戊二酸的浓度为50‑600mg/L；配备用于愈伤继代的培养基，配方为：在改良的MS培养基的基础上添加2,4‑D、6‑BA、TDZ、维生素B1和α‑酮戊二酸；其中2,4‑D的浓度为1‑8mg/L，6‑BA的浓度为0.1‑1mg/L，TDZ的浓度为0.01‑0.1mg/L，维生素B1的浓度为1‑10mg/L，α‑酮戊二酸的浓度为50‑600mg/L；配备芽分化的培养基，配方为：在改良的MS培养基的基础上添加TDZ、NAA、GA和麦芽糖；其中TDZ的浓度为0.5‑3mg/L，NAA的浓度为0.01‑0.4mg/L，GA的浓度为0.05‑0.5mg/L，麦芽糖的浓度20‑40mg/L；配备生根培养基，配方为：将改良的MS培养基营养元素减半，再添加蔗糖和琼脂；其中蔗糖的浓度为10‑30mg/L，琼脂的浓度为8‑12mg/L；所有阶段的培养环境为：光照为40‑80µE/m2/s，温度为26‑28℃，培养基的pH为5.6‑6.0。...

【技术特征摘要】
1.一种运动场用结缕草组织培养快速繁殖的方法，其特征在于包括下列步骤：①外植体选取与消毒；②改良培养基的配备；③愈伤诱导；④愈伤继代；⑤芽分化；⑥生根培养；⑦炼苗与移栽；对培养基的改良方法如下：对MS培养基进行改良，配方为：在基础的MS培养基中加入pvp40和酸水解酪蛋白，其他组分均无变化；pvp-40的浓度为0.1-1mg/L，酸水解酪蛋白浓度为0.15-0.5mg/L；配备用于愈伤诱导的培养基，配方为：在改良的MS培养基的基础上添2,4-D、6-BA、维生素B1和α-酮戊二酸；其中2,4-D的浓度为1-8mg/L，6-BA的浓度为0.1-1mg/L，维生素B1的浓度为1-10mg/L，α-酮戊二酸的浓度为50-600mg/L；配备用于愈伤继代的培养基，配方为：在改良的MS培养基的基础上添加2,4-D、6-BA...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩烈保，袁建波，晁跃辉，谢琦，张娜，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11