一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法技术

本发明专利技术公开了一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法。该方法在悬浮细胞体胚诱导前先用不含２，４－Ｄ的Ｍ２液体培养基预培养７～１０天，经筛网过滤筛选出大小及生长状态较一致的细胞团，接种于体胚诱导培养基上。预培养可使体胚诱导率及其后的植株转换率均提高１倍左右；经筛网过滤所得大小范围为１５４μｍ～９００μｍ的细胞团其体胚诱导效果最佳；大蕉和巴西蕉细胞的最佳接种量分别为０．４ｍｌ２０％ＳＣＶ和１ｍｌ２０％ＳＣＶ。此外在体胚诱导初期于香蕉现有技术体胚诱导培养基上添加ＡＢＡ和抗坏血酸，在一定程度上防止了大蕉在体胚诱导期间培养物容易褐化的现象，并可有效提高大蕉和巴西蕉胚性悬浮细胞的体胚发生频率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于香蕉生物技术育种领域，特别涉及一种有效提高大蕉(Mwfl ABB，ra血/flco Linn.cv.Da Jiao)禾卩巴西蕉(Mm" AAA Cavendish cv. Baxi) 胚性悬浮细胞(ECS)体胚发生频率并成功再生植株的方法。
技术介绍
香蕉(包括大蕉)是世界上最重要的经济作物和农作物之一，也是许多热 带亚热带国家和地区的主要粮食，为近五亿人口提供主食，是继水稻、小麦、 玉米之后的第四大粮食来源。我国香蕉的总产量居全球的第三/四位，广泛种 植于广东、福建、海南、广西和云南等省，产销数额一直雄居南方水果之冠， 被誉称为我国南方的四大水果之一，有着巨大的经济和社会效益。但是目前香 蕉病害猖獗，面临着包括真菌、细菌、病毒和生理性等多种病害的严重烕胁， 其中由尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病能侵染绝大多数香蕉栽培品种，己经成为 我国乃至世界上香蕉毁灭性的病害。我国最受大众欢迎的巴西蕉(A/MaAAA Cavendish cv. Baxi)正是易感香蕉枯萎病的品种之一，而另一栽培种大蕉(Mmm ABBpora^w'aca Linnxv.Da Jiao)已被证实具有抗香蕉枯萎病4号生理 小种的优良特性，但由于其风味口感较差而市场收益不高。因此，如何培育出 抗香蕉枯萎病且具有高经济效益的香蕉新种是目前香蕉产业所面临的迫切问 题。然而大多数栽培蕉是无法产生种子的三倍体，难于利用传统的杂交育种方 式对其种质进行改良。而包括体外诱变、转基因、体细胞杂交等生物技术育种 方式有望可解决香蕉面临的上述问题。建立稳定的香蕉胚性细胞悬浮系(ECSs)及高效的经体胚发生途径的植株再生体系则是香蕉生物技术育种的 前提条件。目前香蕉ECSs可通过多种途径获得，包括未成熟合子胚培养、scalps 培养及未成熟花序培养。以未成熟花序为外植体是获得香蕉ECSs并经体胚发 生途径获得再生植株的较有效和重复性最好的方法，应用此法已经从多个品种 的香蕉中成功获得再生植株。但是这一培养体系亦存在不足之处花序外植体 的采集受抽蕾季节的限制、不同植株花序生理状态的差异、样品采集时气候的不同等诸多因素都影响该体系的稳定性，致使其胚性愈伤组织诱导率通常低于 4%;胚性愈伤组织转换为理想的ECS效率及其体胚发生能力、植株转换率(通常不高于20%)均非常低下。鉴于以上技术瓶颈，目前尚未有建立巴西蕉ECS 和大蕉ECS及其通过体胚发生再生植株的相关报导。
技术实现思路
为了克服上述现有技术存在的不足,本专利技术的目的在于提供一种建立大蕉 和巴西蕉高效体细胞胚胎(简称体胚)发生再生植株的方法。该方法首次建立 大蕉(A/w犯ABBp"rtwfe/aca Linn.cv. Da Jiao)禾口巴西蕉(Mmm AAA Cavendish cv. Baxi)的胚性细胞悬浮系，并提供一种有效的提高其体细胞胚胎发生频率 成功再生植株的方法，为大蕉和巴西蕉的生物技术育种奠定基础。本专利技术的目的通过下述方案实现 一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎 发生再生植株的方法，包括如下步骤.-O)胚性愈伤组织的诱导分别以大蕉或巴西蕉1 12梳未成熟雄花序为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导出胚性愈伤组织。(2) 均一稳定的胚性细胞悬浮系(ECS)的建立挑取步骤(1)诱导出的大蕉黄色小颗粒状胚性愈伤组织或巴西蕉浅黄色小颗粒状胚性愈伤组织，分别转入M2液体培养基，置于90 110rpm摇床上悬浮培养3 4个月即可得较 为分散、均质的大蕉胚性悬浮细胞或巴西蕉胚性悬浮细胞。(3) 体细胞胚胎的诱导在体胚诱导前先将上述胚性悬浮细胞转入不含 2,4-D的M2液体培养基中预培养7 10天，随后经筛网过滤筛选出大小及生 长状态较一致的细胞团，从中吸取0.2 2 ml 20% SCV (settled cell volume, 静置10分钟后所得的细胞沉淀体积)接种于含Img' L ABA和5mg' L—1抗坏血酸的体胚诱导培养基中，置于2s土rc黑暗中进行体细胞胚胎的诱导；将诱导出的白色球形胚转入去除ABA和抗坏血酸的体胚诱导培养基中继续培养直至体胚发育成熟，得到成熟体胚。(4) 体胚的萌发及其植株再生将步骤(3)诱导出的成熟体胚转入体胚 萌发培养基中；置于28土rC黑暗培养，待叶鞘抽出后，将其转至MR生根壮 苗培养基中继续培养，进一步发育成健壮的香蕉小植株。所述不含2,4-D的M2液体培养基的组成为MS基本培养基+4.1 (jmol'L "生物素+680]^101「1谷氨酰胺+100mgL"麦芽提取物+130mmolL'1蔗糖，pH5.3，高温高压灭菌。所述体胚诱导培养基的组成为SH(Schenk和Hildebrandt 1972)大量和微 量元素及其铁盐+ MS维生素+4.5 pmol' L "生物素+680 pmol' L "谷氨酰 胺+211111101丄-1脯氨酸+ 10011^1/1麦芽提取物+ 1.1 pmol'L"NAA + 0.5 iamol' L 激动素+44 ng' L "玉米素+ 29 mmol' L -'乳糖+130 mmol' L "蔗 糖+ 1 mg' L -1 ABA+ 5 mg' L"抗坏血酸+ 2 g' L " Gelrite，其中ABA和抗坏 血酸事先分别配置成10mgmr'母液，过滤灭菌后添加到pH5.8、经高温高压 灭菌后温度降至45r左右的其余培养基成分中混匀，分装于直径9.5cm的培 养皿中，20 25ml/皿。步骤(3)所述20% SCV悬浮细胞是按下述方法制备得到吸取约5ml 悬浮细胞于15ml刻度管中，静置IO分钟后，弃上清，将所得的细胞沉淀体 积用不添加凝固剂Gelrite的体胚诱导培养基稀释至5倍体积。为了更好地实现本专利技术，步骤(3)中经筛网过滤所得细胞团优选大小范 围为154pm 900nm的细胞团。所述大蕉细胞接种量最佳为0.4 ml 20% SCV;巴西蕉细胞接种量最佳为1 ml 20%SCV。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和有益效果(1 )在体胚诱导前采用预培养的方式降低香蕉胚性悬浮细胞外源2,4-D的 含量，可促进悬浮细胞的体胚发生频率。与文献报道的不经预培养直接进行体 胚诱导的方法相比，前者的体胚诱导率及其后的植株转换率均比后者提高1 倍左右(见表1)。(2) 在体胚诱导前使用两种不同孔径的筛网对香蕉胚性悬浮细胞进行过滤 筛选出大小及生长状态较一致的细胞团，可在一定程度上实现体胚诱导的同步 化，从而很大幅度上提高了悬浮细胞的体胚诱导频率。实验结果表明大小在 154pm 90(^m之间的大蕉细胞团的体胚诱导率比其余两种不同大小范围的 细胞团平均高出7.2倍，这在巴西蕉上取得的效果更显著，平均可高出20.5 倍(见表2)。(3) 采用不同的细胞接种量进行香蕉体胚的诱导，结果表明大蕉细胞的接 种量为0.4 ml 20% SCV、巴西蕉细胞的接种量为1 ml 20% SCV时可获得最佳 效果，比其余接种量平均可高出2.8倍(见表2)。本实验室在大蕉和巴西蕉以 外的香蕉品种的试验中也获得了类似的效果，即体胚的诱导存在一个最佳的细胞接种量，不同的香蕉品种略有差异。(4)在体胚诱导初期于体胚诱导培养基上同时添加1 mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立大蕉和巴西蕉高效体细胞胚胎发生再生植株的方法，其特征在于包括如下步骤：（１）胚性愈伤组织的诱导：分别以大蕉或巴西蕉１～１２梳未成熟雄花序为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导出胚性愈伤组织；（２）均一稳定的胚性细胞悬浮系的建立：挑取步骤（１）诱导出的大蕉黄色小颗粒状胚性愈伤组织或巴西蕉浅黄色小颗粒状胚性愈伤组织，分别转入Ｍ２液体培养基中，置于９０～１１０ｒｐｍ摇床上悬浮培养３～４个月即可得分散、均质的大蕉胚性细胞悬浮系或巴西蕉胚性细胞悬浮系；（３）体细胞胚胎的诱导：在体胚诱导前先将上述胚性悬浮细胞转入不含２，４－Ｄ的Ｍ２液体培养基中预培养７～１０天，随后经筛网过滤筛选出大小及生长状态一致的细胞团，从细胞团中吸取０．２～２ｍｌ２０％ＳＣＶ即细胞接种量接种于含１ｍｇ.Ｌ↑［－１］ＡＢＡ和５ｍｇ.Ｌ↑［－１］抗坏血酸的体胚诱导培养基中，置于２８±１℃黑暗中进行体细胞胚胎的诱导；将诱导出的白色球形胚转入去除ＡＢＡ和抗坏血酸的体胚诱导培养基中继续培养直至体胚发育成熟，得到成熟体胚；（４）体胚的萌发及其植株再生：将步骤（３）诱导出的成熟体胚转入体胚萌发培养基中；置于２８±１℃黑暗培养，待叶鞘抽出后，将其转至ＭＲ生根壮苗培养基中继续培养，进一步发育成健壮的香蕉小植株。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：戴雪梅，黄学林，肖望，黄霞，赵杰堂，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]