蛋白的亲和纯化制造技术

我们描述包含细菌免疫多肽的融合蛋白及其在蛋白复合物的亲和纯化中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白的亲和纯化本专利技术涉及用于多肽的亲和纯化中的嵌合融合蛋白。诸如蛋白的生物分子的亲和纯化为本领域已知且允许通过使用靶分子对分子结合伙伴的结合亲和性来纯化分子。例如，葡萄球菌A蛋白结 合免疫球蛋白G且这已被用于从血清中纯化和/或浓缩抗体。"亲和标签" 的其它例子包括麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶、钓调蛋白结合蛋白 和将多组氨酸轨(polyhistidine tracks)工程化为随后通过在含镍基质上的 亲和纯化来纯化蛋白。在许多情况下，能够使用可商购的载体和/或试剂 盒融合感兴趣的蛋白和适当的亲和标签，然后转染至宿主细胞中表达以 及随后提取和在亲和基质上纯化。基因组测序导致编码蛋白的基因的鉴定大量增加。在某些实例中， 简单地通过参考其线性序列不能明显得知基因的功能，期望确定这些未 确定功能的蛋白的功能以及在细胞中与它们相互作用的蛋白伙伴。确定 基因功能的逆向基因组方法费力且耗时。确定通过基因组测序筌定的蛋 白的靶蛋白的物理方法有吸引力，并且可能是通向确认未确定功能的开 ;改阅读框的功能的第一步。此外，在发现已知蛋白的新的潜在活性的努 力中，还可能期望确定已知蛋白的结合伙伴。称为"双杂交"的经典技术被用来鉴定已知蛋白的结合伙伴，例如 在Battel and Fields 1997) The Yeast Two-Hybrid System, Oxford University Press New York中描述的。尽管这项技术已经成功地鉴定了给定蛋白的单 一相互作用伙伴，但其倾向于导致假阳性和假阴性的错误，并且由于该 系统不能鉴定细胞中有时存在的更高级结构而受到限制。WO00/09716中描述了鉴定和分离蛋白复合物的系统。该技术^皮称为 串联亲和纯化(TAP)且使用两部分亲和纯化方法，该两部分亲和纯化方法 使用含有被可切割接头分开的两个不同亲和标签的融合蛋白，该亲和标 签例如A和B。通常，编码靶蛋白的核酸被亚克隆至所述亲和标签之一 的附近。这产生由NH靶蛋白亲和标签B -可切割接头-亲和标签ACOOH组成的融合蛋白。融合构建体被转染至诸如酵母细胞的细胞中并表达。结合靶的蛋白 与融合蛋白相连，将细胞在非变性条件下破碎并将细胞提取物施加到标 签A与之结合的亲和基质上。然后在洗涂后通过切割接头使结合的复合 物从亲和基质上解离下来，所述接头通常为蛋白酶敏感的接头。然后使 用亲和标签B与之结合的第二亲和基质进行第二轮亲和纯化。洗涤第二 筛选步骤且从第二基质上洗脱以提供与把蛋白结合的蛋白的纯化的复合 物。所述两步筛选减少非特异性结合且允许分离蛋白复合物而非单一结 合伙伴。在WO00/09716中，所述第一和第二亲和标签是蛋白A和钙调 蛋白结合蛋白。WO03/095619描述了 TAP的其它实例。在这个例子中， 所述第一和第二亲和标签分别是具有生物素化识别基序的蛋白和六肽组 氨酸标签多肽。希望鉴定对亲和基质有更高亲和力的其它亲和标签，以通过提高亲 合。、、'、土 、、 、 '、 '大肠菌素是蛋白质抗生素家族，由肠杆菌科(Ewtera^"en'acae)在应 激期间产生。这些蛋白通过起离子载体的作用且去极化内层膜或通过在 周质或细胞质中的溶解(例如核酸酶)活性杀灭敏感细菌细胞。通常，大肠 菌素包含中心受体结构域、氨基末端转移结构域和羧基末端细胞毒结构 域。称为酶E型大肠菌素的一类大肠菌素通过与维生素B12受体和位于周 质中的Tol复合体的接触进入细菌细胞中，该Tol复合体引发大肠菌素向 细胞中的转移。已知E大肠菌素有9个群；El是形成离子载体的大肠菌 素，其余的是核酸内切酶或核糖核酸酶。例如，E3、 E4、 E5和E6大肠 菌素是核糖核酸酶，E2、 E7、 E8和E9是非特异性DNA酶。E型大肠菌素在宿主细菌细胞中的表达是有困难的，因为宿主细胞必 须能够严格控制核酸酶的活性，否则宿主细胞核酸就会对核酸酶攻击敏 感。这通过所谓的"免疫蛋白"的共表达克服，"免疫蛋白"是大肠菌 素的抑制剂，其结合大肠菌素核酸酶结构域以中和其活性。免疫蛋白和 大肠菌素的复合物被分泌到细胞外环境中，且是此复合物结合耙细胞。 一旦转移开始，免疫蛋白解离，不再保护靶细胞免受大肠菌素的作用。 这类免疫蛋白的例子是以极高亲和力结合大肠菌素E9的核酸内切酶 (DNA酶)结构域的Im9,其中，在pH7和25。C下复合物的Kd为10"6M (Wallis et al (1995) Biochemistry 34， 13743)。另 一个例子是免疫蛋白Im3, 其结合大肠菌素E3的核糖核酸酶(RNA酶)结构域，其中在pH 7和25 。C 下复合物的Kd为1(T12M (Walker etal (2003) Biochemistry 42, 4161)。这些 非常高的亲和性使得核酸酶-免疫蛋白复合物成为理想的基于亲和性的 纯化模块。在基于亲和性的纯化中使用大肠菌素DNA酶-Im蛋白复合物的其 它吸引因素是DNA酶结构域对其同源Im蛋白伙伴显示类似的高水平特 异性，而高度区别出非同源Im蛋白(Li et al (2004) J. Mol. Biol. 337, 743)。 例如，对大肠菌素E7的DNA酶结构域特异的Im7蛋白以约10—4M的 结合非同源的E9DNA酶结构域，该结合比相同条件下同源免疫蛋白Im9 弱12个数量级。因此，如下文中所述，能够构建双免疫蛋白融合物，其 中对大肠菌素核酸酶柱的结合是对同源伙伴关系特异的。我们在本文中公开亲和纯化方法，其利用免疫蛋白对大肠菌素核酸 酶的非常高的亲和性和特异性。根据本专利技术的方面，提供包含与至少一种异源多肽连接的免疫多肽 的嵌合融合蛋白。优选地，所述免疫多肽与所述异源多肽通过接头分子连接。 在本专利技术的优选实施方案中，所述接头包含可切割的肽接头。 根据本专利技术的方面，提供编码嵌合多肽的核酸分子，该核酸分子包含i) 第一部分，其由附图说明图1或图2所示的、编码至少一个多肽或其活性 结合部分的核酸序列组成，该多肽或其活性结合部分具有与免疫蛋白相 连的活性；或者其由变体核酸分子组成，该变体核酸分子与图1或图2 所示的、编码具有免疫多肽相关活性的多肽的核酸分子杂交；以及ii) 第二部分，其由编码异源多肽的核酸序列组成，其中所述第一和 第二部分相连接。在本专利技术的优选实施方案中，所述第一和第二核酸分子通过接头分 子连接。优选地，所述接头编码可切割的肽接头。在本专利技术的其它优选实施方案中，所述杂交条件是严紧条件。 当两个互补核酸序列经历一定数量的相互的氢键结合时，发生核酸 分子的杂交。杂交的严紧性可以随围绕核酸的环境条件、杂交方法的性质以及所用的核酸分子的组成和长度而变化。在Sambrook et al.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆实'睑室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY， 2001);和Tijssen， Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hybridization with 本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含与至少一种异源多肽连接的免疫多肽的嵌合融合蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：科林克莱安杜斯，西奥内乔治乌，
申请(专利权)人：约克大学，
类型：发明
国别省市：GB[英国]