本发明专利技术公开了一种提高植物耐铝毒能力的植物表达载体及其应用，属于植物基因工程领域。该载体含有大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）苹果酸脱氢酶（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＥＭＤＨ）基因，在苹果酸脱氢酶ＥＭＤＨ基因的上游是Ｒｕｂｉｓｃｏ小亚基的光诱导型启动子。实验结果表明，用该载体转化烟草获得的转基因烟草的苹果酸脱氢酶活性是野生型烟草的１～３．３倍。在１００～３００μＭ的铝毒胁迫下，转ＥＭＤＨ烟草能分泌较多的苹果酸，根系生长较好，对铝毒的耐受性明显增强。本发明专利技术的专用载体能提高植物对铝毒的耐受能力，在植物品种尤其是在中国南方酸性土壤中种植的作物的遗传改良中有很大的应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种提高植物耐铝毒能力的植物 表达载体的构件与应用。技术背景我国南方的土壤大多为红壤，营养贫瘠，呈酸性，使土壤中的磷和施放到 土壤中的磷肥呈不可溶状态，因而植物难以吸收利用，发育受阻，生长量低下。 在酸性土壤里，磷与铝和铁形成溶解度很低的化合物。此外在酸性土壤中，铝 变成了可溶性的，很容易进入植物的根部，抑制根部的生长和发育，使根系不 能吸收水分和摄取营养物，从而导致了作物产量降低，因此在酸性土壤中生长的植物常受铝的毒害。酸性土是典型的低产土壤，其中铝(A1)毒被认为是影响 作物生长的主要限制因子。微摩尔水平的铝离子即可对植物产生毒害，而酸性 土壤溶液中Al"的浓度约为10 100 "mol/L—1 (MaJF. 2000. Role of organic acid in detoxification of aluminum in higher plants.Ce_/_Z尸力7"5"iaZ. 41:383-390)。铝毒害的最初反应是抑制铝敏感基因型植物的根系生长，进而抑 制植物对水分、养分的吸收，影响植物的正常生长发育(DelhaizeE， Ryan PR. 1995. Aluminum toxicity and tolerance in plants, 尸7朋t 尸/"5^'o丄 107:315-332; Foy CD. 1983. The pysiology of plant adaptation to mineal stress. To附分We/7 es. 57:355-392)。在酸性土壤中铝离子对植物危害的 分子机制是多种多样的。 一方面，过多的游离铝和交换性铝离子可以通过抑制 根尖生长发育，造成植株对其它离子及水分的吸收障碍，从而影响植物的生长 发育。另一方面，铝也可以与细胞质中以及膜上蛋白的磷酸基、羟基等极性基 团结合，影响膜的结构和功能。农业生产上常用的措施是在酸性土壤中撒石灰以提高土壤的pH值，然而 在发展中国家的农民经常是负不起施用石灰的费用，另外，播撒石灰不能治理 下层土壤的酸性。随着生物技术的快速发展，人们通过基因工程手段来改造现 有植物品种使之具有耐铝性已成为可能。通过在植物中过量或异位表达有机酸 合成酶基因，如苹果酸脱氢酶与柠檬酸合成酶基因，可以提高植物体内的有机 酸含量，而这些有机酸通过根系分泌到土壤中，熬合土壤中的铝离子，就能解 除酸性土壤中高浓度的铝对植物的毒害。这样不仅可以提高转基因植物对铝毒 的耐受能力，而且还有利于植物对磷等其它必需营养元素的吸收和利用。研究结果表明在酸性土壤上生长良好的植物对铝毒有强的耐受性，植物对 铝毒的抗性在许多情况下与植物分泌有机酸的能力密切相关，在植物体内，有机酸也能够降低铝的毒害作用。有机酸可在质膜的外部螯和铝离子，因此能够 阻止植物对于铝的吸收。已知能有效去除铝毒的有机酸是柠檬酸，草酸，酒石 酸，苹果酸，丙二酸，琥珀酸和醋酸。苹果酸是植物代谢中的一个关键产物， 参与代谢反应中的许多步骤，包括光合作用、气孔和小叶运动、营养吸收、呼吸作用、氮素同化作用和脂肪酸氧化等过程(王忠，王三根，李合声等.2002. 植物生理学(第一版)北京中国农业出版社157-164)。在缺磷的酸性或碱性土 壤中，许多植物会在根部分泌出大量的柠檬酸、草酸或者苹果酸等有机酸，以 螯合土壤中铝、铁等重金属离子，缓解铝毒危害并释放出磷酸根离子供植物吸 收利用。苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)是真核生物和原核生物三羧酸 循环(TCA)的关键酶之一。它在柠檬酸循环中催化苹果酸形成草酰乙酸，也可催 化草酸乙酸形成苹果酸。在植物体内苹果酸的合成是首先通过磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶(PEPC)的作用将磷酸烯醇式丙酮酸转换成草酰乙酸，然后由苹果酸 脱氢酶把草酰乙酸氧化成苹果酸。植物中有好几种类型的MDH和PEPC，并且他 们的表达与它们的功能和组织特异性有关。豆类植物的根瘤中含根瘤特异性的 MDH和PEPC基因，它们的表达水平比其它组织高5-15倍。已经在苜蓿的根瘤 中分离出了一种特异性的新型MDH，这个新型的MDH具有特殊的动力学特性使 它在根瘤中能生产大量的苹果酸。Tesfaye等利用烟草花椰菜花叶病毒CaMV35S 启动子构建了根瘤特异性的MDH基因的植物表达载体，通过农杆菌转染的方法 得到转基因苜蓿(Tesfaye M ， Temple SJ, Allan DL， et al. 2001. Overexpression of Malate dehydrogenase in transgenic alfalfa enhances organic acid Synthesis and confers tolerance to aluminum.尸〗a/7f尸力ysio丄 127: 1836-1844)。他们的实验结果显示转基因苜蓿根尖MDH的活性是对照植物 的1.6倍，根部有机酸的含量提高了4.2倍，根部分泌的柠檬酸，草酸，苹果 酸，琥珀酸和醋酸比未转基因的对照苜蓿提升了7.1倍。当植物生长在含有铝 的酸性培养液中时，转MDH的植株积累的生物量比未转基因的苜蓿高，在含有 铝的水培液或土壤中栽培时，非转基因植物的生长困难，转基因植物生长情况 良好，磷素吸收能力增强。植物根部和叶中其它有机酸的浓度增加，从根部分 泌的有机酸浓度增强，并且伴随抗铝毒能力的提高。崔小英等通过农杆菌介导的遗传转化法将苜蓿根瘤型苹果酸脱氢酶MDH导 入苜蓿胚性愈伤组织，筛选的转化株在20 iliM Ar+溶液中处理24h后根部的伸 长量比对照植株提高3.6% 22.5%，表明在铝毒胁迫处理下过量表达苹果酸 脱氢酶的转基因苜蓿能够更好的生长(崔小英，崔衍波，邓伟等.2004.超量 表达苹果酸脱氢酶基因提高苜蓿对铝毒的抗受性.分子植物育种.2(5) :621-626)。综上所述，在植物中过量表达MDH可以增强植物中有机酸的合 成，因而是一条对付酸性土壤和铝毒危害的有效策略。因为植物的叶片是光合作用器官，光合作用产物可以为有机酸的合成提供 大量的碳骨架，如果在植物叶片的细胞质中过量表达苹果酸脱氢酶(MDH)，就可 以更直接地利用光合作用产物合成苹果酸分泌到细胞外，然后通过根系进入到 土壤中，熬合土壤中的铝离子，提高可溶性磷的含量，促进磷的吸收，解除酸 性土壤中高浓度的铝对植物的毒害。现有的苹果酸脱氢酶基因的植物表达载体 均采用组成型启动子(CaMV35S)， CaMV35S的作用没有组织特异性。用报告基 因的研究结果表明CaMV35S的表达在根中最强，在茎、叶片、花和果实中较弱 (Jefferson等，1987;EMB0， 6:3901-3907)。1, 5 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco) 是植物中表达量最大的蛋白质，这种蛋白质的含量占植物细胞中可溶性蛋白的 40-50%。 Rubisco的小亚基(rbcS)由细胞核基因编码，控制rbcS基因表达的 启动子为光诱导型启动子(PrbcS)， PrbcS的作用有很强的组织特异性，需要 光信号的诱导，在茎中有低水平的表达，在叶片中的表达最强。用报告基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于提高植物耐铝毒能力的载体，是具有光诱导型启动子和苹果酸脱氢酶基因的植物表达载体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈丽梅，玉永雄，李昆志，刘迪秋，赵玥，王奇峰，
申请(专利权)人：昆明理工大学，西南大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]
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