一个在植物中高效表达的载体制造技术

利用烟草花叶病毒（ＴＭＶ）ＲＮＡ的非翻译区序列（ＵＴＲ）构建植物高效表达载体ｐＢｉｎ４４０，包含所述的ＵＴＲ序列与ＧＵＳ报告基因的融合基因构建体，用所说的构建体转化植物外植体所产生的高效表达外源基因（ＧＵＳ）的转基因植株。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程领域，具体地说，本专利技术涉及调控目的基因在植物中高效表达的DNA序列，包含所述的DNA序列与报告基因的融合构建体，携带该构建体的重组表达载体，以及由所述的表达载体转化植物外植体所产生的表达外源基因的转基因植物。在细胞中，一个基因的转录水平主要受其上游的调控序列(即启动子)所控制，所以在分子生物学及生物技术研究与应用中，对启动子的结构和功能的研究一直是一个热门。但转录后mRNA的稳定性及翻译效率对基因的最终产物-蛋白质的产率，有着非常重要的影响，在翻译水平上的调控重要程度并不亚于在转录水平上。许多真核生物(包括病毒)的mRNA的非翻译区序列(UTR)可以通过影响mRNA的稳定性和翻译效率对调节蛋白表达水平起着重要的作用。本专利技术中所述的两段UTR序列来自烟草花叶病毒(TMV)，分别为TMV-RNA的5’端(简称Ω片段，为67bp)和3’端(简称TMV 3’UTR，为204bp的cDNA)。TMV的Ω片段能够提高外源基因的表达。这种增强表达的作用不依赖于任何病毒基因的产物，并且在双子叶植物细胞中的作用比在单子叶中强。Sleat等人认为Ω片段减少了mRNA的二级结构，使得40S核糖体亚基更容易在5’端运动寻找转录起始位点，并且使得5’末端与起始因子的相互作用加强了，因而TMV的Ω片段对翻译有增强作用。这方面的技术已有专利发表(WO87/07644；WILSON；Enhancing translationof mRNA by attaching leader sequence-from--RNA--virus,opt.in form ofcomplementary DNA-,e.g.for improving protein expression in transformedcells.)。而其RNA的3’端UTR可以形成具有复杂高级结构的五个假结(pseudoknot)。在3’最末端的2个假结形成一个在二级结构上类似tRNA的尾巴，这是病毒复制必需的。紧接这个区的上游是另外3个假结(UPD)。Gallie等用原生质体体系研究表明，TMV 3’UTR中UPD的主要作用是提高翻译效率，其机理与真核生物mRNA的poly A的作用机理相似。但以上有关TMV UTR区对外源基因表达影响的研究结果都是在离体细胞表达体系中，报导基因在非整合状态下得到的。本专利技术中首次用TMV5’UTR和3’UTR构建了植物表达载体，并在植株整体水平上，报导基因在整合状态下证明TMV 5’UTR与TMV 3’UTR序列能够增强外源基因的表达，而且证明两个序列共同作用较单独使用5’UTR更能增强外源基因的表达。所以，本专利技术所构建的表达载体pBin440对于研究嵌合基因在整体植物中表达的影响能够更准确地反映TMV UTR在体内的真实作用，它应该是一个新的在植物中高效表达的载体。TMV-外壳蛋白(CP)基因的克隆pGT114含有外壳蛋白编码区及其3’端非翻译区。以PCR方法获得TMV 3’UTRDNA序列(两端分别有SalⅠ及SacⅠ的酶切位点)，经SalⅠ及SacⅠ酶解，将其插入质粒pD513，而构建成pD515；最后经HindⅢ及EcoRⅠ酶解插入pBin438，得到植物高效表达载体pBin440。下文所要叙述的实施例揭示本专利技术人获得的植物表达载体(附图说明图1A)能够在植物中高效表达报告基因以及其他目的基因。本专利技术将首次构建的植物表达载体pBin440与β-glucuronidase(GUS)报告基因的编码区核苷酸序列相融合产生了在植物表达中的重组质粒pBG440，并将这两种重组质粒分别转化入埃西氏大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)和土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciensLBA4404)产生了重组微生物。含有pBin440的埃西氏大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)转化子已保藏到中国微生物菌种保藏保藏管理委员会普通微生物中心，保藏菌种号为CGMCC No.0444。为了证明新的植物表达载体pBin440中TMV 3’UTR对提高外源基因在植物中表达水平的作用，本专利技术利用GUS基因及TMV-RNA非翻译区序列构建了另三种GUS基因的植物表达载体，pBG437(不含TMV 5’UTR和3’UTR),pBG438(仅含TMV 5’UTR)和pBG440 ΔNOS(除不含NOS终止子，其他与pBG440相同)，将重组质粒分别转化入埃西氏大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)和土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciensLBA4404)产生了重组微生物。用叶盘转化法在含有重组质粒pBG440等的土壤农杆菌的介导下将上述各嵌合GUS基因分别导入植物染色体产生了转基因植物。本专利技术涉及调控目的基因编码区的核苷酸序列在植物细胞内高效表达的载体。所述的“植物细胞内高效表达”指在植物细胞的表达水平显著高于无TMV UTR序列的植物表达载体，如pBin437、pBin438(缺3’UTR)等等。本专利技术所构建的植物表达载体利用TMV 5’UTR与3’UTR共同作用以增强插入在这两个序列之间的外源基因在植物体内的表达水平，并第一次在整体植株水平上证明该片段具有增强基因表达的功能。所以本专利技术中的植物表达载体pBin440应是一个新的植物高效表达载体。结合下列附图对本专利技术予以详细说明图1A:pBin440的结构图。 204bp TMV 3’UTR DNA 来自pBR322的BamHⅠ-SalⅠ277bp片段 TMV 5’UTR箭头指基因的转录方向LB-T-DNA左边界序列Knr-在细菌中表达的卡那霉素抗性基因RB-T-DNA右边界序列NPTⅡ-新霉素磷酸转移酶基因，在植物Sc-SacⅠ 中表达对卡那霉素的抗性。SL-SalⅠBm-BamHⅠHd-HindⅢRI-EcoRⅠRK2-RK2复制起点DE35S-带双增强子的CaMV 35S启动子*该图各部分未按比例画出，仅为示意图。图1B植物表达载体pBG437、pBG438、pBG440和pBG440ΔNOS的构建。图2四种不同结构的GUS基因瞬间表达的平均活性(单位pmolMU/min/ug提取总蛋白)。图3转基因烟草GUS活性的分布。图4转基因烟草的GUS平均比活性。图5部分再生植株的PCR结果。实施例1．完整TMV 3’UTR序列的获得TMV外壳蛋白(CP)基因克隆pGT114含有CP基因编码区和3’非编码区。根据3’非编码区序列，设计合成了以下PCR引物UT5:5’CGGTCGACGGTAGTCAAGATGCATAATAAAT 3’31merUT3:5’CTGAGCTCTGGGCCCCTACCGGGGGTAA3’28merPCR反应混合物总体积50ul，含有pGT114DNA～10ng，引物UT5和UT3各5ul，使最终浓度达1umol/L，缓冲液(500mM KCl,100mM Tris-HCl,pH8.8,15mM MgCl2,30mM DTT,1mg/ml BSA)5ul,2mM dNTP 5ul,2U Tag DNA Polymerase。反应在94℃预变性3分钟，然后以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物表达载体，其特征在于启动子下游含有ＴＭＶ５’ＵＴＲ（Ω）和转录终止序列上游含有如下式所述的ＴＭＶ３’ＵＴＲ－ＲＮＡ３’非翻译区的２０４ｂｐ核苷酸的序列。ＧＧＴＡＧＴＣＡＡＧＡＴＧＣＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＣＧＧＡＴＴＧＴＧＴＣＣＧ ＴＡＡＴＣＡＣＡＣＧＴＧＧＴＧＣＧＴＡＣＧＡＴＡＡＣＧＣＡＴＡＧＴＧＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＣＡＣＴＴＡＡＡＴＣＧＡＡＧＧＧＴＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＧＣＧＣＧＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＡＴＡＴＧＧＴＴＣＡＴＡＴＡＣＡＴＣＣＧＣＡＧＧＣＡＣＧＴＡＡＴＡＡＡＧＣＧＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＣＣＧＴＴＡＣＣＣＣＣＧＧＴＡＧＧＧＧＣＣＣＡ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田颖川，秦红敏，郭洪年，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]