本发明专利技术公开了一种农杆菌介导的中国小麦品种新春９号的遗传转化方法。本发明专利技术方法包括如下步骤：用目的农杆菌侵染中国小麦品种新春９号的幼胚，再进行共培养，将目的基因导入小麦幼胚；所述目的农杆菌为将目的基因导入根癌农杆菌菌株ＡＧＬ１得到的。本发明专利技术建立的新春９号新鲜幼胚农杆菌转化体系，转化效率高，可达３．１％，重复性好。因此，本发明专利技术方法对我国小麦品种的遗传改良、完善小麦种质等具有十分重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
自1997年Cheng等首次利用农杆菌介导法转化小麦获得了转基因植株，农杆 菌转化已逐步成为小麦功能基因组学研究的重要工具。与基因枪转化相比，农杆菌 转化具有以下优势目的基因多为单拷贝或低拷贝；插入边界多为T-DNA左右边界， 重排率低;容易排除冗余的质粒DNA序列；容易获得无选择标记的转基因植株(Cheng 等，2004; Jones，2005; Wu等，2006)。与其他农作物相比，小麦农杆菌转化比较困难且进展缓慢。近年来，世界各国 不同的研究小组从小麦基因型、外植体的选择和预处理、农杆菌菌株，Ti质粒、双 元载体及接种和共培养条件等方面，进行了一系列的探索和研究。目前，小麦农 杆菌可转化基因型已报道的主要有Bobwhite (春)，Cadenza (春)，Florida(冬)，Fielder (春)，Veery-5 (春)，Vesna (春)等。外植体类型主要有新鲜 幼胚，预培养1-6天的幼胚，培养14天的胚性愈伤及芽尖和成熟胚愈伤组织(Jones 等，2005)。对Cadenza (春)、Florida (冬)新鲜幼胚和预培养1-6天的胚性愈 伤进行转化研究后发现，新鲜幼胚具有较好的再生和转化效率(Wu等，2003)。 农杆菌菌株和双元载体主要有C58-ABI (pM0N18365) ， C58-ABI (pM0N30139)， C58-CI(pPTN155)， LBA4404(pHK21)和AGL1 (pAL154/pAL156)， AGL0(pBGXI)等，其中， AGL0和AGL1菌株因为还含有致毒力较强的Ti质粒pTiBo542，所以对寄主的侵染 和致瘤能力更强(Cheng等，1997)。Khanna等(2003)通过构建超级双元表达载体服21和在培养基中加入多胺类 化合物，转化效率达到了 1.2-3.9%。 Cheng等(2003)认为农杆菌感染后对外植体 进行干燥处理可显著提高T-DNA转运水平和转化效率。值得指出的是，Hu等(2003) 对基因枪法和农杆菌法转化小麦进行了同步比较，表明农杆菌转化效率明显高于基 因枪法，而且农杆菌法获得的单拷贝整合植株比率显著多于基因枪法，并将EPSPS 基因导入了小麦品种Bobwhite。到2007年1月为止与小麦遗传转化方法有关的国内外专利共计29项，包括有关基因枪转化方法的4项，农杆菌转化方法的8项，原生质体转化方法的2项，其 他转化方法的15项。根据专利保护的地域分类，包括国际专利8项，美国专利14 项，中国专利3项，日本专利1项，英国专利1项，墨西哥专利l项。按照专利保 护的内容主要包括五个方面，转化受体组织的选择(包括小麦幼胚愈伤组织、芽尖、 成熟胚愈伤组织、中胚轴分裂组织外植、悬浮细胞系体、分裂能力强的全能细胞等)； 培养基成分的调整(包括利用硫辛酸提高愈伤组织的再生能力，增加培养基中铜离 子含量等)；转基因再生组织的优化；新型选择标记的使用(包括氨腈水合酶基因 的利用，草甘膦除草剂抗性基因的利用等)；新型表达载体的构建(包括将小麦基 因组序列插入表达载体，利用同源重组提高转化效率)。目前，小麦农杆菌转化多采用LBA4404和C58普通农杆菌菌株，转化频率较低 (0.01-0.5%)，个别转化事件效率高但重现性差。同时，由于小麦基因型、外植 体类型和生理状态对转化效率影响较大，适宜转化的外国品种又难以在中国直接利 用和进行品种改良，因此，引进国外小麦高效农杆菌转化技术，建立中国小麦品种 农杆菌转化体系并加以完善，对我国小麦功能基因组学研究和特异基因资源利用及 小麦商业化生产是十分必要的。新春9号为优质强筋面包春小麦品种，具有较好的组培特性，主要种植在我国新疆和宁夏春麦区。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种转化中国小麦品种新春9号的方法。 本专利技术所提供的转化中国小麦品种新春9号的方法，包括如下步骤用目的农 杆菌侵染中国小麦品种新春9号的幼胚，再进行共培养，将目的基因导入小麦幼胚； 所述目的农杆菌为将目的基因导入根癌农杆菌菌株AGL1得到的。 所述幼胚为授粉12-14天后的心型胚。所述侵染可以包括如下步骤将所述幼胚盾片朝上放置于接种培养基上，再向 其中倒入所述目的农杆菌菌液(OD为1.0-1.5),在黑暗条件下浸泡0.5-1.5小时； 所述菌液中含有终浓度为0. 015%的表面活性剂和终浓度为300-500 uM的乙酰丁香 酮，所述百分含量为体积百分含量；所述乙酰丁香酮的终浓度优选为400uM;所述 浸泡的时间优选为lh。所述共培养的方法可以包括如下步骤将所述侵染后的幼胚置于共培养培养基 中，在22-25°C的温度下暗培养1-3天;所述共培养培养基中包括终浓度为4-10mg/L的氨氯吡啶酸；所述共培养的时间优选为3天；所述氨氯吡啶酸的终浓度优选为 10mg/L。本专利技术的另一个目的是提供一种培育中国小麦品种新春9号的转基因小麦的 方法。本专利技术所提供的培育中国小麦品种新春9号的转基因小麦的方法，包括如下步 骤用上述任一种方法将目的基因导入中国小麦品种新春9号的幼胚中，再进行诱 导培养、再生培养、筛选培养，得到转基因小麦。所述诱导培养可以包括如下步骤将所述共培养后的幼胚置于诱导培养基中， 在22-25'C温度下暗培养1-4周；所述诱导培养基中包括终浓度为150-170mg/L的 特美汀和终浓度为1-2. 5mg/L的氨氯吡啶酸；所述氨氯吡啶酸的终浓度优选为 2.5mg/L;所述诱导培养的时间优选为3周。所述再生培养可以包括如下步骤将经过所述诱导培养后的幼胚置于再生培养 基中，在温度为22-25。C、光照强度为700-800uEs—'m—2、光照时间为14-18h/d的 条件下培养2-4周；所述再生培养基中包括终浓度为150-170mg/l的特美汀；所述 培养的条件优选为所述光照强度为750uEs—V2，所述光照时间为16h/d，所述培 养的时间为3周。所述目的基因可以是通过插入载体pGreen的多克隆位点形成重组载体导入根 癌农杆菌AGL1中的。所述筛选培养可以包括如下步骤将经过所述再生培养的幼胚置于筛选培养基 中，在温度为22-25。C、光照强度为700-800 "Es—'m—2、光照时间为14-18h/d的条 件下培养2-4周；所述筛选培养基中包括终浓度为2-4mg/L的草丁膦和终浓度为 150-170mg/l的特美汀；所述培养的条件优选为所述光照强度为750uEs—V2，所 述光照时间为16h/d，所述培养的时间为3周。所述方法还可以包括如下步骤将经过所述筛选培养的存活植株移至恢复培养 基中，在为22-25。C、光照强度为700-800uEs-'nf2、光照时间为14-18h/d的条件 下培养2-4周；所述恢复培养基中包括终浓度为150-170mg/l的特美汀；所述光照 强度优选为750 u Es—V2，所述光照时间优选为16h/d，所述培养的时间优选为3周。本专利技术建立的新春9号幼胚农杆菌转化体系，转化效率高，可达3.1%，重复性 好。本专利技术方法对Picloram在共培养和诱导培养基中的浓度对愈伤组织再生的影 响进行了研究，结果表明，共培养和诱导培养基中Picloram的浓度分别为4-10m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种转化中国小麦品种新春９号的方法，包括如下步骤：用目的农杆菌侵染中国小麦品种新春９号的幼胚，再进行共培养，将目的基因导入小麦幼胚；所述目的农杆菌为将目的基因导入根癌农杆菌菌株ＡＧＬ１得到的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：夏兰琴，赫德琼斯，陈新民，何中虎，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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