一种猪间充质干细胞培养液及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种猪间充质干细胞培养液及其制备方法，该培养液包含的组分及其含量为：不含动物源成分的基础培养基；胎牛血清：2‑20％；PDGF‑BB因子：5‑10ng/mL。本发明专利技术的细胞培养液与常规的普通间充质干细胞培养液比较，培养的猪脐带胎盘间充质干细胞更具有典型的细胞形态，及具有强的传代能力而不易衰老。本发明专利技术的猪脐带胎盘间充质干细胞培养液，培养出的细胞应用于生产将得到数量更多生物学特性更加稳定的猪脐带胎盘间充质干细胞产品。

A culture medium for pig mesenchymal stem cells and its preparation methods

The invention relates to a pig mesenchymal stem cell culture medium and its preparation method, the medium containing the composition and its content is: basic does not contain animal derived components of culture medium; fetal bovine serum 20%: 2; PDGF BB 10ng/mL factor: 5. Compared with the normal mesenchymal stem cell culture medium, the cell culture medium of the invention has more typical cell morphology and stronger passage ability than that of normal mesenchymal stem cell culture medium, and is not easy to senility. The pig umbilical cord placenta mesenchymal stem cell culture fluid is applied to produce more porcine umbilical cord placenta mesenchymal stem cells with more biological characteristics.

【技术实现步骤摘要】
一种猪间充质干细胞培养液及其制备方法
本专利技术涉及猪脐带和/或胎盘细胞培养
，尤其涉及一种猪脐带和/或胎盘间充质干细胞的培养液。
技术介绍
在干细胞治疗应用于人类之前，各种动物，如小鼠，牛，兔和猪来源间充质干细胞(MSCs)对不同疾病的治疗效果已被广泛研究。其中，猪与人有许多相似之处，如器官的大小、生理和功能。因此，猪一直被认为是对体内研究和临床前评估有价值的模型动物。猪MSCs已从多器官组织成功分离，如骨髓，皮肤，脐带血，脐带，子宫内膜，羊水和外周血。猪骨髓MSC在向间质细胞和功能性细胞的体外分化和转分化方面显示很大潜能，如能够分化为心肌细胞、神经细胞、肝细胞。另外，猪MSC具备免疫调节作用和低免疫原性，应用猪MSC进行异种移植治疗方面的研究是安全和可行的。猪脐带胎盘MSCs具有间充质干细胞的所有特性，如贴壁培养，多向分化(成脂、成骨细胞、软骨细胞、神经元)，表达CD29、CD44、CD90、CD105，同时不表达造血细胞表面标志物如CD45、CD34、CD11b、HLA-DR。目前同种异体来源的猪骨髓MSCs被用于治疗急性心肌梗死、慢性缺血性心肌病、急性肝衰竭、皮肤修复再生和骨软骨缺损等猪疾病模型。猪脐带胎盘MSCs已用于治疗神经性疾病，例如大鼠的大脑损伤以及小鼠的帕金森氏病。就像从成人和胎儿组织中分离MSCs一样，应用特定的培养基和操作流程，同样可以从不同组织中分离和扩增猪MSCs。目前，绝大多数的MSCs分化和功能实验是基于骨髓来源的MSCs。从活体猪骨髓中分离MSCs相对困难，多数情况下不得不将实验对象处死后进行骨髓MSCs的分离。然而，猪胎盘和脐带来源MSCs能够以剖腹产的形式从母猪体内获得，同时母猪和新生幼猪都能存活，对母体和幼崽没有任何损伤。猪MSCs的扩增可以应用不同的培养基，如DMEM，TCM199/DMEM(1:1)，α-MEM，高糖DMEM等。目前研究者应用添加2－20％胎牛血清(FBS)的培养基进行MSCs的体外扩增和传代。体外培养MSCs形成的克隆数与FBS的浓度呈现明显相关性，当不添加FBS时无克隆形成，可能是由于含高浓度血清的培养基中存在一些目前未知的生长因子。目前，尚没有经过验证能够有效培养猪胎盘脐带MSCs的培养基配方。我们专利技术了一种猪胎盘和/或脐带间充质干细胞培养基配方，为促进猪脐带和/或胎盘干细胞的进行更好的扩增培养，以保证细胞的质量和数量，以备更好的用于猪脐带和/或胎盘间充质干细胞的生物学特性和临床前试验研究。
技术实现思路
本专利技术提供了一种猪脐带和/或胎盘间充质干细胞培养液及其制备方法，为促进猪脐带和/或胎盘间充质干细胞的进行更好的扩增培养，以保证细胞的生物学特性的稳定和足够的细胞数量，以备更好的用于猪脐带和/或胎盘间充质干细胞的生物学特性鉴定和临床前试验研究。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种猪脐带和/或胎盘间充质干细胞的培养液，该培养液包含的组分及其含量为：不含动物源成分的基础培养基；胎牛血清：2-20％；PDGF-BB因子：5-10ng/mL。优选地，该培养液中还含有bFGF因子，含量为5-10ng/mL。更优选地，该培养液中还含有hEGF因子，含量为5-10ng/mL。优选地，所述不含动物源成分的基础培养基选自DMEM/F12培养基、M199培养基、1640培养基中的一种。优选地，所述的胎牛血清为进口胎牛血清，胎牛血清加入培养基之前要进行0.22的滤膜进行过滤。更优选地，该培养液包含的组分及其含量为：不含动物源成分的基础培养基；胎牛血清：2-20％；PDGF-BB因子：5ng/mL；bFGF因子：5ng/mL；hEGF因子：5ng/mL。本专利技术还提供了上述猪脐带和/或胎盘间充质干细胞的培养液的制备方法，该方法包括如下步骤：(1)完全培养基制备：将基础培养基和胎牛血清混合后，进行膜过滤除菌，分装冷冻保存，标记为完全培养基，-20℃保存；(2)PDGF-BB因子用完全培养基溶解，调整浓度到1ng/μL，并进行分装，-80℃冻存保存；(3)猪脐带和/或胎盘间充质干细胞培养时，步骤(2)保存的PDGF-BB因子要在冰上融化，然后加入到步骤(1)的完全培养基中，PDGF-BB因子的终浓度为5-10ng/mL；即制得该培养液。优选地，步骤(3)中还包括向完全培养基中添加bFGF因子，bFGF因子的终浓度为5-10ng/mL，bFGF因子在添加前，用完全培养基溶解，调整浓度到1ng/μL，并进行分装，-80℃冻存保存。优选地，步骤(3)中还包括向完全培养基中添加hEGF因子，hEGF因子的终浓度为5-10ng/mL，hEGF因子在添加前，用完全培养基溶解，调整浓度到1ng/μL，并进行分装，-80℃冻存保存。优选地，步骤(3)中向完全培养基中添加PDGF-BB因子、bFGF因子、hEGF因子，终浓度均为5ng/mL。优选地，所述步骤(1)中基础培养基和胎牛血清的体积比为9:1。本专利技术还提供了一种间充质干细胞的培养方法，该方法包括如下步骤：将猪脐带和/或胎盘间充质干细胞接种于上述的猪脐带和/或胎盘间充质干细胞培养液中进行培养。优选的，所述培养条件为37℃和CO2的体积浓度为5％；优选的，所述细胞的接种密度为2*104-1.5*105个/mL。本专利技术所具有的有益效果为：本专利技术的猪脐带和/或胎盘间充质细胞培养液与常规的间充质干细胞培养液相比，能使猪脐带和/或胎盘间充质干细胞的增殖能力更强，传代周期更短，培养的细胞更具有间充质干细胞的形态，具有更好的传代能力，细胞的表型更加单一、细胞纯度高、且细胞的活性更强，新培养体系培养的猪脐带和/或胎盘间充质干细胞从形态、增生、细胞表型和生物学特点和功能更加符合间充质干细胞的特点。因此，本专利技术涉及的猪脐带和/或胎盘间充质干细胞培养液应用于生产和实践，将生产出更高的质量和效益的猪脐带和/或胎盘间充质干细胞，为猪脐带和/或胎盘间充质干细胞的生物学特性研究、临床前试验研究提供足够的间充质干细胞制剂，更好的发挥猪作为多种疾病模型动物的优点。附图说明：图1为不同因子的培养液对细胞的培养情况。图2为不同浓度的bFGF、hEGF和PDGF-BB因子对细胞的培养情况。图3为因子组合、对照组对不同株猪间充质干细胞的培养情况。具体实施方式下面结合附图与具体实施方案对本专利技术进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本专利技术的保护范围。取剖腹产猪脐带、胎盘检测合格后，用pH值为7.2-7.4的磷酸缓冲液冲洗去除残留血液，并浸泡胎盘、脐带组织15分钟；后剪成1-2cm3的小块，再次用磷酸缓冲液清洗，去除残留血液，胎盘、脐带粉碎后加入1-1.5倍的磷酸缓冲稀释液(pH7.2-7.4)，取一份组织混合物加入同体积的一胶原酶和胰酶混合物，胶原酶和胰酶体积比为1:1，胶原酶浓度为0.2％～0.5％，胰酶浓度为0.1％～0.5％，溶液体积为组织体积的1/2，将容器置于恒温磁力搅拌器上消化30-40分钟，转速为90-120转/分钟，温度37℃；所得的消化混合物通过不锈钢过滤网后，再将滤液通过100-200目筛，滤过液为细胞混悬液，将滤过液再次通过1000目筛，滤过液重新加入容器中进行再次消化，用完全培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪脐带和/或胎盘间充质干细胞的培养液，其特征在于：该培养液包含的组分及其含量为：不含动物源成分的基础培养基；胎牛血清：2‑20％；PDGF‑BB因子：5‑10ng/mL。

【技术特征摘要】
1.一种猪脐带和/或胎盘间充质干细胞的培养液，其特征在于：该培养液包含的组分及其含量为：不含动物源成分的基础培养基；胎牛血清：2-20％；PDGF-BB因子：5-10ng/mL。2.根据权利要求1所述一种猪脐带和/或胎盘间充质干细胞的培养液，其特征在于：该培养液中还含有bFGF因子，含量为5-10ng/mL。3.根据权利要求1或2所述一种猪脐带和/或胎盘间充质干细胞的培养液，其特征在于：该培养液中还含有hEGF因子，含量为5-10ng/mL。4.根据权利要求3所述一种猪脐带和/或胎盘间充质干细胞的培养液，其特征在于：该培养液包含的组分及其含量为：不含动物源成分的基础培养基；胎牛血清：2-20％；PDGF-BB因子：5ng/mL；bFGF因子：5ng/mL；hEGF因子：5ng/mL。5.权利要求1所述猪脐带和/或胎盘间充质干细胞的培养液的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：(1)完全培养基制备：将基础培养基和胎牛血清混合后，进行膜过滤除菌，分装冷冻保存，标记为完全培养基，-20℃保存；(2)PDGF-BB因子用完全培养基溶解，调整浓度到1ng/μL，并进行分装，-80℃冻存保存；(3)猪脐带和/或胎盘间充质干细胞培养时，步骤(2)保存的PDGF-BB因子要在冰上融化，然后加入到步骤(1)的完全培养基中，PDGF-BB因子的终浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾红红，韩之波，赵钦军，
申请(专利权)人：天津昂赛细胞基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12