稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液及制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液及制备方法和用途，其方法为：(1)用完全培养基对分离得到的间充质干细胞进行培养至P3‑P5代：(2)取获得的同一代次的同种异体来源的4‑8株间充质干细胞分别复苏，取4‑8株等细胞数量进行混合,在完全培养基中培养，待融合度为60％‑90％；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养，收集上清，并得到培养后的细胞；上清过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液。本发明专利技术培养液中未添加血清，且整个制备过程中未添加抗生素和激素类产品，从而保证了最终得到的细胞条件培养液的安全性，防止因异种蛋白过敏或抗生素以及激素过敏而引发的安全性问题。

Mesenchymal stem cell conditioned medium stably expressing cytokines and its preparation method and Application

The invention discloses a conditioned medium for stable expression of cytokines, a preparation method and a use thereof. The method comprises: (1) culturing separated mesenchymal stem cells in a complete medium to the P3 P5 generation; (2) resuscitating 4 8 mesenchymal stem cells from the same generation, and mixing 4 8 cells with the same number of cells in a complete culture. When cultured in medium, the degree of fusion was 60%-90%. When cultured in serum-free phenol red DMEM/F12 medium, the supernatant was collected and cultured, and then the cultured cells were filtered to obtain the medium of mesenchymal stem cells with stable expression of cytokines. The culture medium of the invention does not add serum, and antibiotics and hormone products are not added in the whole preparation process, thereby ensuring the safety of the final cell conditioned culture medium and preventing the safety problems caused by allergies to heterogeneous proteins, antibiotics and hormones.

【技术实现步骤摘要】
稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液及制备方法和用途
本专利技术涉及一种细胞条件培养液及制备方法，具体涉及一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液及制备方法和用途。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是干细胞家族的重要成员，源于早期的中胚层和外胚层，具有高度自我更新能力和多项分化潜能。目前，因间充质干细胞具有造血支持，促进干细胞植入，高度的分化能力和免疫调控等功能，越来越受到人们的广泛关注。间充质干细胞存在于全身的多组织中，可以在体外进行扩增培养在特定的诱导条件下，可以分化为成硬骨、软骨、脂肪、神经心肌、内皮等多种其他类型的细胞。在体外能进行连续培养，可以作为理想的种子细胞用于病变和衰老引起的组织器官损伤修复。胎盘、脐带间充质干细胞主要来源有孕妇产后的脐带，胎盘等组织，所以其取材方便，无道德伦理问题的限制。胎盘、脐带间充质干细胞能够分泌多种因子，能维系干细胞的增殖，分化和存活。目前，亟需一种利用间充质干细胞制备稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液。本专利技术的第二个目的是提供一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的用途。本专利技术的第四个目的是提供包含一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的组合物。本专利技术的技术方案概述如下：稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的制备方法，包括如下步骤：(1)用完全培养基对分离得到的间充质干细胞进行培养至P3-P5代：(2)取步骤(1)获得的同一代次的同种异体来源的4-8株间充质干细胞分别复苏，取4-8株等细胞数量进行混合,在完全培养基中培养，待融合度为60％-90％；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养12-24小时，收集上清，并得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液。上述方法还包括如下步骤：(1)将所述培养后的细胞换完全培养基进行培养15-24小时后，消化传代，待融合度为60％-90％；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养12-24小时，收集上清，再得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液；(2)重复步骤(1)1次。完全培养基是由体积比9:1的DMEM/F12和血清组成。间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、表皮间充质干细胞、牙髓间充质干细胞或毛囊间充质干细胞。上述方法制备的稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液。上述稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液在制备治疗角膜炎药物、制备修复创伤药物或在制备化妆品中的应用。一种含有稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的组合物，包括下述组分；稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液，丙三醇、丁二醇，透明质酸钠、维生素C，柠檬酸和人血白蛋白。上述组合物，还可以包括下述组分：稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液50mL，丙三醇1-3mL，丁二醇1-3mL，透明质酸钠1-2.5g，维生素C0.1-1.5g，柠檬酸0.1-2.5g，人血白蛋白0.5-2g，用去离子水补至100mL，溶解混匀后，-20℃保存。本专利技术的优点：1.本专利技术的一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液中未添加细胞培养常用到的血清，且整个制备过程中未添加抗生素和激素类产品，从而保证了最终得到的细胞条件培养液的安全性，防止因异种蛋白过敏或抗生素以及激素过敏而引发的安全性问题；2.本专利技术的培养液在收集后在无菌环境行下经过了0.22μm的无菌混合纤维滤膜，从而保证最终收集到的培养液上清没有有害微生物残留以及细胞或大型碎片残留，保证了该培养液在实际应用中的安全性。3.本专利技术中所得的一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液选取同种异体来源的细胞进行混合培养，会使得所得到培养液中的所分泌的细胞因子含量更加的稳定，混合后可以持续传代3-4代，分泌细胞因子保持稳定状态，易于质量控制。4.本专利技术所的一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液可以作为医用药品滴眼液的原料，可以改善治疗眼部疾病，改善视疲劳，以及眼部手术的恢复。5.本专利技术所一种稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液作为生物美容用的原料等，添加到面膜，面霜，爽肤水，精华液等化妆品产品中，可以制备成相应的产品，由于其含有丰富的活细胞分泌因子，可以加速皮肤的新陈代谢，具有抗氧化和促进皮肤的修复再生的功能。附图说明图1间充质干细胞形态。图2不同株细胞P4-P8代所分泌得不同因子的分析结果ABCD(Y轴单位pg/mL)。图3不同株细胞进行重复饥饿培养后HGF因子分泌结果(Y轴单位pg/mL)。图4干细胞条件培养液对大鼠皮损的治疗作用。具体实施方式下面结合附图与具体实施例对本专利技术作进一步说明，其具体实施例应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本专利技术的保护范围。实施例1稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的制备方法,包括如下步骤：(1)将分离得到的人脐带间充质干细胞接种至完全培养基中(完全培养基是由体积比9:1的DMEM/F12和血清组成)中，37℃，5％CO2培养箱内培养，细胞融合度到80％-90％的时候，进行传代培养，用0.25％W/V胰蛋白酶对原代培养的细胞进行酶解消化，时间为2分钟，酶解完成后加入配置好的完全培养液，终止酶解并吹打细胞，再按1:6的比例进行传代培养，培养装置为75cm2无菌塑料培养瓶，取少量进行流式分析，进行细胞表型鉴定，细胞培养到P4代进行冻存；选取五株细胞进行流式分析，结果如下，实验证明按以上分离得到的细胞具有明显的间充质干细胞的特征(图1)。表1、间充质干细胞的表面标记表达量抗体类别CD73CD90CD105CD34CD45CD11bHLA-DRMSC197.38％99.87％98.47％0.64％0.31％0.31％0.45％MSC298.23％99.56％99.01％0.58％0.47％0.37％0.52％MSC398.99％99.12％99.05％0.63％0.51％0.49％0.57％MSC499.01％99.65％98.99％0.55％0.29％0.52％0.40％MSC599.03％99.05％99.01％0.68％0.62％0.60％0.67％(2)取获得的P4代同种异体来源的5株人脐带间充质干细胞分别复苏，取5株等细胞数量进行混合,，使得5株细胞总数1.2×106个细胞接种到含10mL完全培养基的T75cm2无菌培养瓶中培养，待融合度为80％；去细胞培养基，用DPBS溶液对细胞清洗一次，去掉残留的血清等，换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养24小时，收集上清，并得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液。(3)用上面的培养后的细胞换完全培养基进行培养20小时后，消化传代(P5代)，待融合度为80％；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的制备方法，其特征是包括如下步骤：(1)用完全培养基对分离得到的间充质干细胞进行培养至P3‑P5代：(2)取步骤(1)获得的同一代次的同种异体来源的4‑8株间充质干细胞分别复苏，取4‑8株等细胞数量进行混合,在完全培养基中培养，待融合度为60％‑90％；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养12‑24小时，收集上清，并得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液。

【技术特征摘要】
1.稳定表达细胞因子的间充质干细胞条件培养液的制备方法，其特征是包括如下步骤：(1)用完全培养基对分离得到的间充质干细胞进行培养至P3-P5代：(2)取步骤(1)获得的同一代次的同种异体来源的4-8株间充质干细胞分别复苏，取4-8株等细胞数量进行混合,在完全培养基中培养，待融合度为60％-90％；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养12-24小时，收集上清，并得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是包括如下步骤：(1)将所述培养后的细胞换完全培养基进行培养15-24小时后，消化传代，待融合度为60％-90％；换无血清无酚红DMEM/F12培养基，饥饿培养12-24小时，收集上清，再得到培养后的细胞；上清用0.22μm的无菌微孔滤膜进行过滤，获得稳定表达细胞因子的间充质干细胞培养液；(2)重复步骤(1)1次。3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述完全培养基是由体...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩之波，贾红红，赵钦军，
申请(专利权)人：天津昂赛细胞基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12