用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组，所述引物组包括扩增引物对、探针及PNA。本发明专利技术还提供一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒，所述试剂盒包括含有扩增引物对和探针的第一套PCR反应体系及含有扩增引物对、探针和PNA的第二套PCR反应体系。本发明专利技术还提供一种检测方法，将待检DNA模板分别用第一套PCR反应体系和第二套PCR反应体系进行扩增，通过获得两套PCR反应体系的CT值及其差值定性判断EGFR基因19外显子缺失突变。本发明专利技术具有检测快速、操作简便、高灵敏、高通量的特点，可用于组织或血液临床标本的EGFR基因19外显子缺失突变的检测。

【技术实现步骤摘要】
用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法
本专利技术涉及分子检测
，特别的，涉及一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
EGFR表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表达产物，定位于细胞膜上。目前已经报道不下30种EGFR基因突变与药物反应性有关，但绝大部分是外显子19上的缺失突变。通过对患者EGFR基因的突变检测，可辅助临床医生筛选可受益于分子靶向抗肿瘤药物如易瑞沙、特罗凯和凯美纳等的肿瘤患者。临床上大都采用病理组织标本提取DNA进行EGFR检测，但晚期肺癌病人有时无法获取肿瘤标本。血液(血浆)肿瘤基因突变检测方便在不同时间点获取样本，没有空间抽样偏差，已逐渐在临床上推广应用。近年来的研究还表明，癌症病人的血浆中能否检测到癌细胞逸出的突变DNA，以及分析血浆中肿瘤基因含量的变化，可以为肿瘤的疗效监测及预后提供重要的参考。采用血浆检测EGFR基因突变检测的是来源于肿瘤组织的体细胞突变，不同于检测一般性的遗传突变；在血浆中存在大量野生型DNA。传统的测序法要求突变含量达到20％以上才能有效检出，因此不适合用于血浆EGFR基因突变检测。《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》已于2015年发布，推荐采用突变基因特异扩增PCR法(ARMS法)用于血浆EGFR基因突变检测。研究表明，19外显子缺失型中以2种E746-A750del突变型(2235_2249del15和2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的70％左右，其它缺失型出现频率都较低。由于外显子19上存在大量缺失类型，而ARMS法要求对每种突变类型都设计特异性引物，不能对未知突变类型进行检测。目前商品化的ARMS法EGFR检测试剂盒最多只能检测19种19外显子缺失型。肽核酸(PeptideNucleicAcid，PNA)由丹麦科学家在1991年最先先成。PNA是具有类多肽骨架的DNA类似物，主链骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA/DNA杂交的TM值比DNA/DNA高15℃，但PNA与DNA若有单碱基错配，则结合能力很弱或不结合。PNA钳制PCR检测基因突变的原理是：通过设计一条涵盖突变位点的15-25bp长的PNA，其序列与野生型序列完全匹配，当PCR的模板为野生型时，PNA与其完全匹配，引物延伸受阻，扩增可受到强烈地抑制；而当PCR的模板为突变型时，PNA与其存在哪怕是一个碱基的错配，两者间的杂交能力急剧下降或完全消失，引物延伸不受影响，扩增可以正常进行。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法，针对EGFR基因的19号外显子区域，在缺失突变位置两端的保守区域设计一对PCR引物，在PCR上游引物3’端附近的保守区域设计一条探针；在缺失突变位置设计一条与EGFR野生型基因完全匹配的PNA序列，基于PNA钳制PCR检测基因突变的原理对肿瘤组织标本或血液(血浆)中提取的DNA进行检测，具有检测速度快、检测类型多及灵敏度高的优点。具体地：本专利技术提供一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组，所述引物组包括扩增引物对、探针及PNA，其中：所述扩增引物对序列如下：正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；所述PNA序列为：NH2-5’-GATGTTGCTTCTCTTAATTCC-3’-COOH。本专利技术同时提供一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒，所述试剂盒包括两套PCR反应体系，第一套PCR反应体系包括针对EGFR基因19外显子野生型和缺失突变检测设计的扩增引物对及探针，其中：所述扩增引物对序列如下：正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；所述第一套PCR反应体系还包括2×PCRbuffer、DNA模板和去离子水；第二套PCR反应体系包括针对EGFR基因19外显子缺失突变检测设计的扩增引物对、探针及PNA，其中：所述扩增引物对序列如下：正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；所述PNA序列为：NH2-5’-GATGTTGCTTCTCTTAATTCC-3’-COOH；所述第二套PCR反应体系还包括2×PCRbuffer、DNA模板和去离子水。在本专利技术提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述第一套PCR反应体系的成分终浓度为：1×PCRbuffer、0.2μM正向引物、0.2μM反向引物、0.2μM探针和1μLDNA模板。在本专利技术提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述第二套PCR反应体系的成分终浓度为：1×PCRbuffer、0.2μM正向引物、0.2μM反向引物、0.2μM探针、2μMPNA和1μLDNA模板。在本专利技术提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。在本专利技术提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述阳性对照品为EGFR基因突变型质粒，所述阴性对照品为EGFR基因野生型质粒，所述空白对照品为无核酸酶水。本专利技术同时提供一种检测EGFR基因19外显子缺失突变的方法，所述检测EGFR基因19外显子缺失突变的方法包括如下步骤：步骤一：取待检测样本抽提的DNA，作为PCR模板；步骤二：提供如上文所述的试剂盒，取出适量第一套PCR反应体系和第二套PCR反应体系，将适量PCR模板分别与第一套PCR反应体系和第二套PCR反应体系分别混匀；步骤三：两套PCR反应体系均进行PCR扩增反应：95℃预变性5min；45cycles，95℃15sec，58℃30sec；步骤四：PCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品、阴性对照器和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到两套PCR反应体系的CT值及其差值定性判断EGFR基因19外显子缺失突变。相较于现有技术，本专利技术提供的用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组、试剂盒及方法的有益效果在于：本专利技术针对EGFR基因的19号外显子区域，在缺失突变位置两端的保守区域设计一对PCR引物，在PCR上游引物3’端附近的保守区域设计一条TAQMAN-MGB荧光检测探针；在缺失突变位置设计一条与EGFR野生型基因完全匹配的PNA序列，基于PNA钳制PCR检测基因突变的原理对肿瘤组织标本或血液(血浆)标本中提取的DNA进行检测，建立了检测EGFR基因19外显子缺失突变的实时PCR定量方法，该方法的灵敏度为1％～0.5％，最低可以在100倍的野生型基因背景下检测出低至1个拷贝的EGFR突变型基因，其灵敏度与ARMS法相当，但突变检测类型却多于ARMS法，可筛查出更多缺失突变，适用于高通本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组，其特征在于，所述引物组包括扩增引物对、探针及PNA，其中：所述扩增引物对序列如下：正向引物：5’‑TCCCAGAAGGTGAGAAAGT‑3’；反向引物：5’‑GGATTTCCTTGTTGGCTTT‑3’；所述探针序列为：FAM‑5’‑ATTCCCGTCGCTATC‑3’‑MGB；所述PNA序列为：NH2‑5’‑GATGTTGCTTCTCTTAATTCC‑3’‑COOH。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的引物组，其特征在于，所述引物组包括扩增引物对、探针及PNA，其中：所述扩增引物对序列如下：正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；所述PNA序列为：NH2-5’-GATGTTGCTTCTCTTAATTCC-3’-COOH。2.一种用于检测EGFR基因19外显子缺失突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括两套PCR反应体系，第一套PCR反应体系包括针对EGFR基因19外显子野生型和缺失突变检测设计的扩增引物对及探针，其中：所述扩增引物对序列如下：正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；所述第一套PCR反应体系还包括2×PCRbuffer、DNA模板和去离子水；第二套PCR反应体系包括针对EGFR基因19外显子缺失突变检测设计的扩增引物对、探针及PNA，其中：所述扩增引物对序列如下：正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；所述探针序列为：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；所述PNA序列为：NH2-5’-GATGTTGCTTCTCTTAATTCC-3’-COOH；所述第二套PCR反应体系还包括2×PCRbuffer、DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张戈，滕祥云，黄少亚，
申请(专利权)人：长沙三济生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43