人EML4‑ALK融合基因检测方法技术

本发明专利技术公开的一种人EML4‑ALK融合基因检测方法，其在EML4E2‑ALKE20、EML4E3‑ALK E20、EML4E6‑ALK E20、EML4E13‑ALK E20、EML4E14‑ALK E20、EML4E15‑ALK E20、EML4E17‑ALK E20、EML4E18‑ALKE20、EML4E20‑ALK E20的EML4端融合外显子上各设计一条引物，在ALK的20号外显子上设计另一条共用反向引物，Taqman‑MGB探针设计在ALK的20号外显子上。通过一个混合反应，和一个内参反应，实现对9种EML4‑ALK融合类型的检测。

【技术实现步骤摘要】
人EML4-ALK融合基因检测方法
本专利技术涉及生物检测
,特别涉及一种人EML4-ALK融合基因检测方法。
技术介绍
EML4-ALK融合基因定位于2号染色体的短臂上(2p21和2p23)，其5’端为EML4的片段，3’端为ALK的片段，由倒置后的EML4基因片段与残余的ALK片段连接。EML4基因可在多个位点发生断裂，断开后的氨基末端片段取代了ALK的胞外域及跨膜域，直接与位于ALK第20外显子的胞内催化域相连，形成多种EML4-ALK融合基因突变体。EML4-ALK的信号转导通路为PI3-K/Akt、STAT3/5、Ras-MEK和PLC-γ/PIP2等，这些通路与细胞存活、增殖和迁移密切相关。EML4-ALK基因融合可促使ALK基因引起致癌融合蛋白的表达，引起基因表达和信号的激活和失调，进而促使表达这些蛋白的肿瘤细胞增殖和存活。在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，ALK重排的阳性率大约为3～5％，在腺癌、从未吸烟或少量吸烟的患者中EML4-ALK融合的几率更高。2011年，美国食品和药品管理局(FDA)批准克唑替尼用于治疗间变型淋巴瘤激酶(ALK)基因重排的非小细胞肺癌(NSCLC)。克唑替尼是一种小分子酪氨酸激酶受体抑制剂，靶向分子包括ALK、肝细胞生长因子受体(HGFR，c-Met)和ROS1。EML4-ALK融合基因阳性患者不能从EGFR-TKI的基础治疗中受益，表现为原发耐药。而针对EML4-ALK融合基因阳性的患者，使用克唑替尼等针对ALK基因的小分子抑制剂可以获得良好的临床治疗效果。因此在使用针对ALK基因的小分子抑制剂前，需进行EML4-ALK融合基因突变的检测。目前对人EML4-ALK融合基因的检测方法主要有：荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)、免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)、荧光定量PCR等。虽然FISH是目前EML4-ALK融合基因检测的金标准，但是FISH检测对操作和判读技术要求较高，诊断医师必须经过严格的FISH操作和结果判读培训，只有经FISH操作经验丰富的医师判定结果才具有可靠性；目前FISH检测的成本昂贵、通量低。IHC通过检测ALK蛋白的过表达来检测融合，但是由于ALK蛋白的差异表达水平较低，其敏感性和重复性较差，而且不同实验室间没有标准的操作流程，同样的检测结果会存在不同的解释。FISH和IHC不能用于肿瘤组织外的其他样本。荧光定量PCR检测灵敏度高，成本相对较低，通量高，周期短，而且适用的样本范围较广，除可检测组织样本外，还可检测液体样本。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对现有人EML4-ALK融合基因检测方法所存在的上述技术问题而提供一种采用实时荧光PCR方法,能够检出EML4-ALK的以下9种融合类型的人EML4-ALK融合基因检测方法。本专利技术所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：一种人EML4-ALK融合基因检测方法，其特征在于，在EML4E2-ALKE20、EML4E3-ALKE20、EML4E6-ALKE20、EML4E13-ALKE20、EML4E14-ALKE20、EML4E15-ALKE20、EML4E17-ALKE20、EML4E18-ALKE20、EML4E20-ALKE20的EML4端融合外显子上各设计一条引物，在ALK的20号外显子上设计另一条共用反向引物，Taqman-MGB探针设计在ALK的20号外显子上。通过一个混合反应，和一个内参反应，实现对9种EML4-ALK融合类型的检测。在本专利技术的一个优选实施例中，所述引物和探针如下：在本专利技术的一个优选实施例中，具体步骤如下：(1)RNA提取；RNA提取使用离心柱型天根石蜡包埋组织切片总RNA提取试剂盒；具体操作步骤如下：(1.1)将石蜡样品切成5-10μm厚的片状；注意:如果样品表面暴露于空气中,最初的2～3片弃掉不用。(1.2)迅速将2-8张切片置于1.5mlRNase-Free的离心管中，加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10sec；(1.3)室温15-25℃，12,000rpm(～13,400×g)离心2min；(1.4)用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀；(1.5)加入1ml无水乙醇于沉淀中，涡旋混匀。(1.6)室温15-25℃，12000rpm(～13,400×g)离心2min；(1.7)用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀(用一个新的枪头小心吸出残余的乙醇)；(1.8)打开管盖，室温15-25℃或37℃放置10min直至残余的乙醇挥发完全；注意:完全去除残余的乙醇很重要，残余的乙醇会对RNA产生影响。(1.9)加入200μl裂解液RF以及10μlProteinaseK于沉淀中，彻底涡旋混匀；(1.10)55℃孵育15min之后80℃孵育15min。(1.11)室温15-25℃，12,000rpm(～13,400×g)离心5min，转移上清入新的RNase-Free离心管中；(1.12)加入220μl的缓冲液RB，涡旋混匀；(1.13)加入660μl的无水乙醇，涡旋混匀(可能会出现沉淀)；(1.14)转移700μl溶液和沉淀入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；(1.15)重复步骤(1.15)，直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱CR3，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(1.16)DNaseI工作液的配制：取10μlDNaseI储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻柔混匀；(1.17)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNaseI工作液，室温放置15min；(1.18)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RW1，室温15-25℃，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；(1.19)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；(1.20)重复步骤(1.19)；(1.21)室温(15-25℃)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液；将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；注意：此步骤目的是将吸附柱CR3中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验；(1.22)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μlRNase-FreeddH2O，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，得到RNA溶液；注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μl，体积过小影响回收效率；RNA溶液请于-70℃保存；配置胶用RNA专用系统；(2)RNA反转录成cDNA；RNA反转录使用PrimeScriptTM1ststrandcDNASynthesisKit(TaKaRa),按照试剂盒说明书操作。具体步骤如下：(2.1)准备如下反应体系(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人EML4‑ALK融合基因检测方法，其特征在于，在EML4 E2‑ALK E20、EML4 E3‑ALK E20、EML4 E6‑ALK E20、EML4 E13‑ALK E20、EML4 E14‑ALK E20、EML4 E15‑ALK E20、EML4 E17‑ALK E20、EML4 E18‑ALK E20、EML4 E20‑ALK E20的EML4端融合外显子上各设计一条引物，在ALK的20号外显子上设计另一条共用反向引物，Taqman‑MGB探针设计在ALK的20号外显子上。通过一个混合反应，和一个内参反应，实现对9种EML4‑ALK融合类型的检测。

【技术特征摘要】
1.一种人EML4-ALK融合基因检测方法，其特征在于，在EML4E2-ALKE20、EML4E3-ALKE20、EML4E6-ALKE20、EML4E13-ALKE20、EML4E14-ALKE20、EML4E15-ALKE20、EML4E17-ALKE20、EML4E18-ALKE20、EML4E20-ALKE20的EML4端融合外显子上各设计一条引物，在ALK的20号外显子上设计另一条共用反向引物，Taqman-MGB探针设计在ALK的20号外显子上。通过一个混合反应，和一个内参反应，实现对9种EML4-ALK融合类型的检测。2.如权利要求1所述的一种人EML4-ALK融合基因检测方法，其特征在于，所述引物和探针如下：3.如权利要求1或2所述的一种人EML4-ALK融合基因检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)RNA提取；RNA提取使用离心柱型天根石蜡包埋组织切片总RNA提取试剂盒；具体操作步骤如下：(1.1)将石蜡样品切成5-10μm厚的片状；注意:如果样品表面暴露于空气中,最初的2～3片弃掉不用。(1.2)迅速将2-8张切片置于1.5mlRNase-Free的离心管中，加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10sec；(1.3)室温15-25℃，12,000rpm(～13,400×g)离心2min；(1.4)用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀；(1.5)加入1ml无水乙醇于沉淀中，涡旋混匀。(1.6)室温15-25℃，12000rpm(～13,400×g)离心2min；(1.7)用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀(用一个新的枪头小心吸出残余的乙醇)；(1.8)打开管盖，室温15-25℃或37℃放置10min直至残余的乙醇挥发完全；注意:完全去除残余的乙醇很重要，残余的乙醇会对RNA产生影响。(1.9)加入200μl裂解液RF以及10μlProteinaseK于沉淀中，彻底涡旋混匀；(1.10)55℃孵育15min之后80℃孵育15min。(1.11)室温15-25℃，12,000rpm(～13,400×g)离心5min，转移上清入新的RNase-Free离心管中；(1.12)加入220μl的缓冲液RB，涡旋混匀；(1.13)加入660μl的无水乙醇，涡旋混匀(可能会出现沉淀)；(1.14)转移700μl溶液和沉淀入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；(1.15)重复步骤(1.15)，直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱CR3，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。(1.16)DNaseI工作液的配制：取10μlDNaseI储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μlRDD溶液，轻柔混匀；(1.17)向吸附柱CR3中央加...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪元涛，朱月艳，孙子奎，
申请(专利权)人：上海派森诺生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31