一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法技术

本发明专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法。本发明专利技术考虑了中国人群与欧美人群肝癌基因谱的差异性，筛选出与中国人肝癌易感相关基因的SNPs以及与肝癌相关的基因突变位点的组合，利用核酸质谱仪对肝癌相关的遗传学标识进行广泛(高通量检测位点、高通量检测样本)筛查和检验。通过本发明专利技术的方法检出成功率高、技术重现性好、性价比高，可实现单个小样本多基因的检测，满足小样本最大化使用；本发明专利技术的方法是基于MassARRAY核酸质谱技术，较Sanger测序具有高准确性、高灵敏性的技术优势，检测结果稳定，提高了检测阳性率。

A detection method of nucleic acid mass spectrometry for early screening of the susceptibility genes of liver cancer

The present invention relates to the field of gene detection, in particular to a method for detecting nucleic acid mass spectrometry for early screening of the susceptibility genes of liver cancer. The invention considers the difference spectrum of liver cancer gene Chinese population in Europe and the United States population, screening and Chinese liver cancer susceptible genes related to SNPs and in combination with the liver cancer related gene mutations, using nucleic acid mass spectrometry identification of hepatocellular carcinoma associated genetics are widely (high flux detection sites, high-throughput screening and testing samples) test. Through the method of the invention of the detection technology of high success rate, good reproducibility and high performance price ratio, we can detect the single small sample and multi gene, meet the small sample maximum use; the method of the invention is MassARRAY nucleic acid mass spectrometry based on technical advantages compared with Sanger sequencing with high accuracy, high sensitivity, stable test results, improve the positive rate of detection.

【技术实现步骤摘要】
一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法
本专利技术属于基因检测领域，具体涉及一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法。
技术介绍
原发性肝癌(HepatocellularCarcinoma,HCC)是我国乃至全世界上常见，且具有危害性的恶性肿瘤之一，我国每年新发病例约占全球45％，是全世界致死率高居第三的恶性肿瘤，尽管随着各种新技术、新疗法的出现和诊疗水平的提高，肝癌的疗效有了很大的改善，但是我国肝癌年死亡率仍高达20.40/10万，约占全世界肝癌死亡率的1/2。肝癌的发生是多基因多因素参与的复杂过程，是环境与遗传因素共同作用的结果。研究学者发现：肝癌发生发展是一个受遗传学调控的过程。近年来遗传学机制在肝癌发生发展中的作用已成为研究的重点内容。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNPs)是一种遗传标记，是指基因组水平上由于单核苷酸的变异，而引起的DNA序列的多态性。在人群中的发生频率大于1％，包括单碱基的转换、颠倒以及单碱基的插入或缺失等形式表现，是一种新的遗传标志，可以为疾病的预测、诊断、治疗以及新型药物的研制提供可靠的有效的科学根本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)筛选出可用来评估个体罹患肝癌风险的特异性和敏感性的基因SNPs和基因突变位点；(2)设计步骤(1)的肝癌易感SNPs位点和基因突变位点的扩增引物和单碱基延伸引物；(3)将步骤(2)中的扩增引物分组，各组中所含的各SNP位点和基因突变位点的上下游引物等摩尔混合，得到对应的扩增引物混合液，每管扩增引物混合液的最终工作浓度为0.5μM；(4)依照步骤(3)中扩增引物分组的方式，将步骤(2)中的单碱基延伸引物分组，每一组根据其所含的每一条延伸引物的分子量，按相应体积进行混合，分别得到单碱基延伸引物混合液；(5)以待测样品外周...

【技术特征摘要】
1.一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)筛选出可用来评估个体罹患肝癌风险的特异性和敏感性的基因SNPs和基因突变位点；(2)设计步骤(1)的肝癌易感SNPs位点和基因突变位点的扩增引物和单碱基延伸引物；(3)将步骤(2)中的扩增引物分组，各组中所含的各SNP位点和基因突变位点的上下游引物等摩尔混合，得到对应的扩增引物混合液，每管扩增引物混合液的最终工作浓度为0.5μM；(4)依照步骤(3)中扩增引物分组的方式，将步骤(2)中的单碱基延伸引物分组，每一组根据其所含的每一条延伸引物的分子量，按相应体积进行混合，分别得到单碱基延伸引物混合液；(5)以待测样品外周血基因组DNA为模板，对步骤(3)中的每组扩增引物混合液分别进行PCR扩增，所得扩增产物最终在4℃保存；(6)应用核酸外切酶和虾碱式磷酸酶消化步骤(5)的扩增产物；(7)将步骤(6)纯化后的产物进行单碱基延伸反应：分别将步骤(6)中纯化后的每组扩增产物加入步骤(4)中对应的延伸引物混合液，即第一组扩增产物加入第一组延伸引物混合液，第二组扩增产物加入第二组延伸引物混合液，第三组扩增产物加入第三组延伸引物混合液；(8)脱盐树脂纯化延伸产物；(9)MassARRAY平台检测分析进行芯片点样、扫描，检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果，通过观察质谱峰变异碱基处是否出峰来判断是否存在基因变异。2.根据权利要求1所述的一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，其特征在于：所述可用来评估个体罹患肝癌风险的特异性和敏感性的基因SNPs位点在NCBI中的SNP数据库的rs号分别为rs4730775、rs2233682、rs17006625、rs1800630、rs7574865、rs4678680、rs12979860、rs1056836、rs34237608、rs230496、rs1800566、rs28362491、rs17401966、rs4444903、rs2596542、rs648202、rs455804、rs9267673、rs2280883、rs3761549、rs9275319、rs9272105和rs8013403。3.根据权利要求1所述的一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，其特征在于：所述可用来评估个体罹患肝癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点分别为c.121A>G、c.110C>G、c.133T>C和c.747G>T。4.根据权利要求1所述的一种用于肝癌易感相关基因的核酸质谱早筛的方法，其特征在于：所述肝癌易感SNPs基因位点和肝癌易感基因突变位点的PCR引物、延伸引物的序列为：rs4730775PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTGAAGGGTGATGGGCAGTTAG-3'下游5'-ACGTTGGATGGTTTCCAGAGCTAACTCGTG-3'延伸引物：5'-TTAGCAGACGGCGGA-3'rs2233682PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCGAGTGTACTACTTCAACC-3'下游5'-ACGTTGGATGTGCCCGTTTTTGCCACCACT-3'延伸引物：5'-gCACTAACGCCAGCCA-3'rs17006625PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACCTTCTTCTCCTTTTGCCG-3'下游5'-ACGTTGGATGGGGAAGATGAGGTTGAATTG-3'延伸引物：5'-GCCGGGGCAGTTATCA-3'rs1800630PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGCTATGGAAGTCGAGTATGG-3'下游5'-ACGTTGGATGTTCCATACCTGGAGGTCCTG-3'延伸引物：5'-GCCCTGTCTTCGTTAAG-3'rs7574865PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGAGTGTGTATGCAGTAAAAG-3'下游5'-ACGTTGGATGAATCCCCTGAAATTCCACTG-3'延伸引物：5'-GTTGGTGACCAAAATGT-3'rs4678680PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCATGGGACTCTGATACAATA-3'下游5'-ACGTTGGATGTTCTGCCTTGGGTTTGTTC-3'延伸引物：5'-TGCTTTCTTCCCTTTTCT-3'rs12979860PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCGTGCCTGTCGTGTACTGA-3'下游5'-ACGTTGGATGAGCGCGGAGTGCAATTCAAC-3'延伸引物：5'-caCAATTCAACCCTGGTTC-3'rs1056836PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCCTTGTCCAAGAATCGAGC-3'下游5'-ACGTTGGATGCAACCAGTGGTCTGTGAATC-3'延伸引物：5'-TCCGGGTTAGGCCACTTCA-3'rs34237608PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGTGGAGTCAGACAGATATGG-3'下游5'-ACGTTGGATGCAGGCACCTGGGAAGACTA-3'延伸引物：5'-CCTGGGAAGACTAGATGAG-3'rs230496PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGACCACATGTCTGGATTTGC-3'下游5'-ACGTTGGATGTGGGCCACCTTTAAGAGTAG-3'延伸引物：5'-ggtgAGGTCAGGGGCAAAC-3'rs28362491PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCTATCAGCGGCACTGCCAC-3'下游5'-ACGTTGGATGTAGGGAAGCCCCCAGGAAG-3'延伸引物：5'-tCCTGCGTTCCCCGACCATTG-3'rs1800566PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTGTGCCCAATGCTATATGTC-3'下游5'-ACGTTGGATGTTCTGTATCCTCAGAGTGGC-3'延伸引物：5'-acGGCTTCCAAGTCTTAGAA-3'rs17401966PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCAGCACTTAATGAAAACAC-3'下游5'-ACGTTGGATGAACCTCTAAGAACACTTGAC-3'延伸引物：5'-CTAAGAACACTTGACTCAATA-3'rs4444903PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCTTTCAGCCCCAATCCAAG-3'下游5'-ACGTTGGATGAGAGCAAGGCAAAGGCTTAG-3'延伸引物：5'-gaaaTGATG...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚小云，刘梦梅，刁波，
申请(专利权)人：武汉赛云博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42