一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒及其制备和使用方法技术

本发明专利技术涉及免疫检测领域，具体涉及一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，包括包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液、VEGF参考品、VEGF质控品、VEGF酶结合物、浓缩洗涤液和发光底物液。本发明专利技术还涉及该试剂盒的制备和使用方法。本发明专利技术的检测试剂盒具有检测结果准确、稳定性好、特异性强、灵敏度高、线性范围宽、检测时间短、使用方便，适于推广应用等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒及其制备和使用方法
本专利技术涉及免疫检测领域，具体涉及一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒及其制备和使用方法。
技术介绍
近来对肿瘤生长的不断深入研究，发现血管生成对肿瘤的生长起着至关重要的作用。血管生成是在促血管生成因子的作用下，内皮细胞从静止状态变为有迁移能力的顶细胞，以出芽的形式向周围扩增、迁移、逐步形成完整的新生血管的过程。一般认为，成人的血管处于相对静止的状态，其血管生成只出现在妊娠期、子宫内膜周期性重建及肿瘤、类风湿性关节炎、心血管疾病、子宫内膜异位等疾病中，其中肿瘤是研究最多的一种。而这一过程受多种促血管生成因子和血管生成抑制因子的调节，其中血管内皮细胞生长因子(VEGF)是最重要的促血管生成因子之一。VEGF是一个分子量为45KD的高度糖基化的碱性蛋白，是一种有高度特异性的促进血管内皮细胞分裂，诱导血管新生的因子，它可以特异地作用于血管内皮细胞，促进血管生成，维持血管的正常状态和完整性，提高血管通透性。血管内皮细胞生长因子参与许多病理和生理的表达，在参与骨折愈合的表达全过程中起到重要因素，在糖尿病肾病的发病过程中会表达增强，另外在对白血病和严重肢体缺血的表达中可作为一种基因治疗的药物。研究发现，VEGF在许多病理生理过程中都有表达，例如创伤修复中的血管内皮细胞和巨噬细胞、糖尿病视网膜病变细胞、心脑血管病和肝脏疾病等，并以自分泌、旁分泌和胞内分泌的方式特异地作用于血管内皮细胞膜上的VEGF受体从而引发细胞内信号转导而实现的。在众多血管生成因子当中，VEGF是公认的主要的诱导血管生成的物质，它能强烈地促进血管内皮有丝分裂和新生血管形成。磁微粒化学发光法是酶标记免疫分析技术的新发展，该技术将磁性微球应用于免疫检测的固相，大大提高了反应的表面积，增加了抗原或抗体的吸附量，加快了反应速度，提高了检测的灵敏度。相比于时间免疫分辨荧光、免疫层析及ELISA方法，具有准确度高、特异性好、精密度高、线性范围广、试剂稳定性良好等特点；目前磁微粒化学发光免疫分析技术已成为在免疫诊断领域全球使用最广泛的分析方法，也是免疫试剂重要的发展方向之一。现有技术血管内皮细胞生长因子的检测方法主要有酶联免疫法、时间分辨荧光免疫分析法、化学发光法等，然而这些方法具有线性范围窄，检测时间长等缺点，无法满足临床需求，因此寻找一种更有效的检测方式就成了临床应用的关键。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种用于检测血管内皮细胞生长因子的检测试剂盒；该试剂盒检测结果准确、稳定性好、特异性强、灵敏度高、线性范围宽、检测时间短、使用方便，适于推广应用。为了实现上述专利技术的目的，本专利技术的技术方案是：一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，所述检测试剂盒包括包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液、VEGF参考品、VEGF质控品、VEGF酶结合物、浓缩洗涤液和发光底物液。作为一种优选的技术方案，所述包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:2500-1:7500的比例配制；所述VEGF酶结合物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的VEGF单克隆抗体,且所述VEGF酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:1000-1:5000的比例稀释；所述VEGF参考品和所述VEGF质控品均由VEGF标准品与参考品稀释液配制而成，所述VEGF参考品的浓度分别为0pg/mL、30pg/mL、125pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL；所述VEGF质控品的浓度为125pg/mL、1000pg/mL。作为一种进一步优选的技术方案，所述包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:5000的比例配制，所述VEGF酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:3000的比例稀释。作为一种优选的技术方案，所述参考品稀释液为pH7.5的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有18-22gBSA、14-15gEDTA、3.8-4g2-巯基乙醇和0.3-0.5mL的Proclin-300。作为一种优选的技术方案，所述浓缩洗涤液为0.04-0.06mol、pH7.4-pH7.6的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.04-0.06％v/v的吐温-80和0.7-0.8％v/v的Proclin-300。作为一种优选的技术方案，所述发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B,所述发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.4-0.6g和对位碘酚0.007-0.008g；所述发光底物液B为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g和过氧化氢0.1-0.3ml。本专利技术的第二个目的在于：提供一种检测血管内皮细胞生长因子的检测试剂盒的制备方法。为了实现上述专利技术的目的，本专利技术的技术方案是：一种检测血管内皮细胞生长因子的检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)制备VEGF磁性微球混悬液将经过N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺活化后的磁微粒加磁场，吸出上清液，用pH5-6、浓度为0.01-0.05mol/L的吗啉乙磺酸缓冲液清洗，并用上述吗啉乙磺酸缓冲液按照浓度为20-60mg/mL将磁微粒进行悬浮，加入VEGF抗体，再加磁场，用含有0.1-1.0％w/v牛血清白蛋白、pH为7.3-7.5、0.01-0.05mol/L的磷酸缓冲液封闭2-6小时后，再用含有吐温-20、牛血清白蛋白和Proclin-300的磷酸盐缓冲液清洗，并用该溶液配制成1-4mg/mL的磁性微球混悬母液，再将所述磁性微球混悬母液按1:2500-1:7500稀释，制得VEGF磁性微球混悬液；(2)制备VEGF参考品及质控品用参考品稀释液将VEGF标准品按一定的比例稀释成系列参考品，其参考品浓度范围为0pg/mL-2000pg/mL；按照上述操作制备浓度为125pg/mL、1000pg/mL的质控品，并以0.5mL/支对参考品和质控品进行分装、冻干；(3)配制VEGF酶结合物将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的VEGF单克隆抗体溶液与酶结合物稀释液按照1:1000-1:5000的比例配制；(4)配制浓缩洗涤液按照每1LpH7.5的Tris-HCl缓冲液中含有7-10gNaCl、0.3-0.6ml吐温-80和6-8mlProclin-300进行配制；(5)配制发光底物液A和发光底物液B发光底物液A：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.03-0.06g、对位碘酚0.006-0.008g和110-130μl盐酸的添加量配制来配制，调节pH为9；发光底物液B：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、过氧化氢0.1-0.3ml和110-130μl盐酸的添加量配制，调节pH为9；(6)将上述步骤(1)-(5)制备的磁性微球混悬液、酶结合物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B分别进行分装。作为一种改进的技术方案，所述磁微粒为粒径1-3μm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液、VEGF参考品、VEGF质控品、VEGF酶结合物、浓缩洗涤液和发光底物液。

【技术特征摘要】
1.一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液、VEGF参考品、VEGF质控品、VEGF酶结合物、浓缩洗涤液和发光底物液。2.根据权利要求1所述的一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:2500-1:7500的比例配制；所述VEGF酶结合物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的VEGF单克隆抗体,且所述VEGF酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:1000-1:5000的比例稀释；所述VEGF参考品和所述VEGF质控品分别由VEGF标准品与参考品稀释液配制而成，所述VEGF参考品的浓度分别为0pg/mL、30pg/mL、125pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL；所述VEGF质控品的浓度为125pg/mL、1000pg/mL。3.根据权利要求2所述的一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述包被有VEGF抗体的磁性微球混悬液的浓度按照1:5000的比例配制，所述VEGF酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:3000的比例稀释。4.根据权利要求2所述的一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述参考品稀释液为pH7.5的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有18-22gBSA、14-15gEDTA、3.8-4g2-巯基乙醇和0.3-0.5mL的Proclin-300。5.根据权利要求1所述的一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液为0.04-0.06mol、pH7.4-pH7.6的Tris-HCl缓冲液，且每1L缓冲液中还含有0.04-0.06％v/v的吐温-80和0.7-0.8％v/v的Proclin-300。6.根据权利要求1所述的一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒，其特征在于：所述发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B,所述发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.4-0.6g和对位碘酚0.007-0.008g；所述发光底物液B为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g和过氧化氢0.1-0.3ml。7.一种如权利要求1所述血管内皮细胞生长因子检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述制备方法包括下列步骤：(1)制备VEGF磁性微球混悬液将经过N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺活化后的磁微粒加磁场，吸出上清液，用pH5-6、浓度为0.01-0.05mol/L的吗啉乙磺酸缓冲液清洗，并用上述吗啉乙磺酸缓冲液按照浓度为20-60mg/mL将磁微粒进行悬浮，加入VEGF抗体，再加磁场，用含有0.1-1.0％w/v牛血清白蛋白、pH为7.3-7.5、0.01-0.05mol/L的磷酸缓冲液封闭2-6小时后，再用含有吐温-20、牛血清白蛋白和Proclin-300的磷酸盐缓冲液清洗，并用该溶液配制成1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨致亭，吴佳玲，李贞，姜小建，杨锋斌，
申请(专利权)人：潍坊市康华生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37