一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系及其构建方法与应用。所述细胞系为慢病毒诱导表达T7pol/P/N的BHK(TetOn)细胞系，所述的弹状病毒构建方法是将病毒聚合酶基因质粒pL及弹状病毒核心骨架质粒pCore双质粒按照特定的比例转染BHK(T7pol/P/N‑TetOn)细胞系快速获得重组弹状病毒。诱导表达T7pol/P/N的载体通过pGag/Pol，pRSV‑Rev和pMD2.G慢病毒质粒系统整合于BHK(TetOn)细胞基因组。本发明专利技术能高效的对弹状病毒组装进行快速拯救并完成筛选鉴定，与传统的多质粒拯救系统相比大大的提高重组弹状病毒的拯救效率。

A cell line and its construction method and application of inducible to save the ironlike virus

The invention provides a cell line of inducible to save the ironlike virus and its construction method and application. BHK lentivirus induced T7pol/P/N expression of the cell line (TetOn) cell lines, rhabdovirus the construction method is the virus polymerase gene of plasmid pL and rhabdovirus core backbone plasmid pCore double plasmid according to specific proportion of BHK (T7pol/P/N TetOn) fast recombinant rhabdovirus cell line. Induced T7pol/P/N expression vector by pGag/Pol, pRSV Rev and pMD2.G lentiviralvector system integrated in BHK (TetOn) cell genome. The invention can efficiently rescue and complete the screening and identification of the virus, and greatly improve the rescue efficiency of recombinant rotavirus compared with the traditional multi plasmid rescue system.

【技术实现步骤摘要】
一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系及其构建方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系及其构建方法与应用。
技术介绍
弹状病毒科(Rhabdoviridae)的病毒粒子形态似棒状或子弹状。“Rhabdo”系来自希腊文的“Rhabdos”，意为杆状。病毒粒的大小为(130～380)×70nm，核心为螺旋对称的核壳，内含单股负链RNA。病毒感染宿主细胞时，由病毒粒内的RNA多聚酶转录成mRNA。核壳外层具脂蛋白包膜，膜上有糖蛋白突起。病毒在细胞质内增殖，以芽生方式释放。一些病毒只在哺乳动物、鱼类、节肢动物或其他无脊椎动物体内增殖，有许多病毒具有节肢动物和脊椎动物体两种寄主，还有一些侵染植物及某些植食性节肢动物。某些侵染脊椎动物的病毒有广泛的实验寄主范围，植物弹状病毒在高等植物中寄主范围窄，有些在介体昆虫体内复制并可在昆虫培养细胞中生长。没有一种弹状病毒在脊椎动物或植物上可垂直传播，有些弹状病毒在植物之间可以机械传播。以弹状病毒属的水泡性口炎病毒VSV来说，VSV可以在绝大多数体外培养细胞上生长，它增殖迅速在短时间内即可达到很高滴度；同时是一种高效的干扰素本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系，其特征在于：为慢病毒诱导表达T7pol/P/N的BHK(TetOn)细胞系，即稳定表达TetOn3G蛋白的BHK21（IFNAR1 KO）细胞，且I型干扰素识别受体基因缺失，保藏日期为2017年8月15日，存活检测日期为2017年8月28日，且结果为存活，保藏编号为CCTCC NO：C2017128，分类命名为T7pol/P/N BHK(TetOn)仓鼠胚肾细胞，保藏地址为中国武汉武汉大学。

【技术特征摘要】
1.一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系，其特征在于：为慢病毒诱导表达T7pol/P/N的BHK(TetOn)细胞系，即稳定表达TetOn3G蛋白的BHK21（IFNAR1KO）细胞，且I型干扰素识别受体基因缺失，保藏日期为2017年8月15日，存活检测日期为2017年8月28日，且结果为存活，保藏编号为CCTCCNO：C2017128，分类命名为T7pol/P/NBHK(TetOn)仓鼠胚肾细胞，保藏地址为中国武汉武汉大学。2.基于权利要求1所述的一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系的构建方法，其特征在于，步骤1，将弹状病毒聚合酶基因质粒pL与弹状病毒核心骨架质粒pCore双质粒按照1：9的比例转染BHK(T7pol/P/N-TetOn)细胞获得重组弹状病毒；步骤2，将诱导表达T7pol/P/N的载体基因通过pGag/Pol，pRSV-Rev和pMD2.G慢病毒质粒系统整合于BHK(TetOn)细胞基因组，所述的BHK(TetOn)细胞系由合成的TetOn3G的基因片段连接到慢病毒载体FG，整合到BHK21（IFNAR1KO）细胞。3.根据权利要求2所述的一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，质粒的构建：构建pT7pol、pP、pN质粒；通过特异性引物将弹状病毒磷蛋白基因P、核蛋白基因N以及T7polRNA聚合酶基因进行扩增，并对扩增产物进行双酶切，然后通过T4连接酶连接至载体，提取pDonor-T7pol、pDonor-P、pDonor-N中间过渡质粒；S2，慢病毒表达载体构建：分别采用杀稻瘟菌素、嘌呤霉素、新霉素三种抗生素标志基因作为慢病毒感染细胞后的筛选标志物，克隆到慢病毒诱导表达载体上；S3，慢病毒载体构建：通过基因克隆技术，将构建好的pDonor-T7pol、pDonor-P、pDonor-N中间质粒的相对应的目的基因同源重组到可诱导型的慢病毒表达载体上，形成三种诱导表达慢病毒质粒pGFP-T7pol、pRFP-P和pYFP-N；S4，BHK21（IFNAR1KO）的细胞构建：利用CRISPR-Cas9的技术，设计针对鼠源IFNAR1的sgRNA，引导Cas9发生特定位点的基因编辑，产生双...

【专利技术属性】
技术研发人员：王红伟，楼建华，徐章敏，
申请(专利权)人：南京普菲科医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32