抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用技术

技术编号:3826660 阅读:159 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术公开了一种抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用,以及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株SCRV-G-1B2,CCTCC No:C200918。其制备步骤是:以纯化的鳜鱼弹状病毒为抗原,免疫BALB/c小鼠,经细胞融合,产生融合的杂交瘤细胞,再经间接ELISA筛选和有限稀释法单克隆化,获得稳定分泌抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明专利技术能获得活性更高、特异性更强、数量更多的鼠脾脏淋巴细胞,以保证所获得的融合杂交瘤细胞效果更好。使用小鼠脾脏强化免疫技术的融合率为96.3%,阳性率达到97%。本发明专利技术单克隆抗体可用于对鳜鱼弹状病毒感染的免疫检测,也可用于对鳜鱼弹状病毒糖蛋白在宿主的组织或细胞中的定量和定位分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水产动物病毒单克隆抗体
,更具体涉及一种抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白 的单克隆玩体,同时还涉及抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白的单克隆抗体的制备方法,分泌抗鳜鱼弹 状病毒糖蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞的融合、分离、鉴定与扩增培养,涉及抗鳜鱼弹状 病毒糖蛋白的单克隆抗体对鳜鱼弹状病毒感染的免疫检测,还涉及抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白的 单克隆抗体在鳜鱼弹状病毒糖蛋白在宿主的组织或细胞中的定量和定位分析中的用途。
技术介绍
鱼类弹状病毒是一类引起鱼及其他水生动物致死性和流行性病害的重要病毒病原,呈世 界性分布,给淡、海水水产养殖业造成巨大的经济损失和严重烕胁,现已报道的鱼类弹状病 毒达十几种。 20世纪90年代开始,本实验室从患流行病 的鳜鱼组织中分离鉴定出了鳜鱼弹状病毒(5Y/w> rcs c加stw' rhabdovirus, SCRV)。进一步 对鳜鱼弹状病毒的全基因组进行测序,结果揭示鳜鱼弹状病毒的基因组为不分节段的单股 负链RNA'大小为11545 bp,编码5种结构蛋白,即核蛋白(Nucle叩rotein, N)、磷酸化 蛋白(Phosphoprotein, P)、基质蛋白(Matrix protein, M)、糖蛋白(Glycoprotein, G)禾口 RNA聚合酶(Polymerase, L),序列比对显示鳜鱼弹状病毒与弹状病毒科的水疱性口炎病毒 属的成员的亲缘关系最近。对于鱼类弹状病毒病,尚缺乏治疗药物和方法,早期检测和诊断仍是预防该病毒病传播 的主要途径。鱼类弹状病毒病原的检测可以通过细胞培养、电镜观察、RT-PCR及免疫学等方 法进行。其中,具有特异性强的单克隆抗体对鱼类弹状病毒病原进行检测,不仅具有快速、灵 敏的优点,而且适于大规模现场检测应用。另外,在对鱼类弹状病毒的基础研究中,单克隆 抗体还能用于相应病毒多肽在宿主体内或培养细胞中的表达、定位及病毒与宿主相互作用等 研究。国内外虽有屈单克隆抗体检测鱼类弹状病毒的报道(Dixon和Longshaw, Dis Aquat Org, 2005, 67: 25-29; Zhou等,Viral Immunol, 2006, 19: 637-645; Chen等,Vet Immunol I,unopathol, 2008, 123: 266-276 ),但至今尚未见鳜鱼弹状病毒单克隆抗体相关文献与 专利。因此,抗鳜鱼弹状病毒的单克隆抗体亟待研发。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白的单克隆抗体,所述的单克隆抗体是由保藏编号为CCTCC No: C200918的小鼠杂交瘤细胞株SCRV-G-1B2分泌产生。 SCRV-G-1B2细胞增殖后可制备大量所需的特异抗体;SCRV-G-1B2细胞注射小鼠后,产生的 小鼠腹水单抗ELISA效价为1:105; SCRV-G-1B2细胞株细胞活性高,液氮中冻存6-8个月后,仍能快速复苏并保持良好活性。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白的单克隆抗体的制备方 法。在分离免疫鼠脾脏细胞之前,通过将纯化鳜鱼弹状病毒直接注射小鼠脾脏进行强化免疫, 可获得活性更高、特特异性更强、数量更多的鼠脾脏淋巴细胞,以保证所获得的融合杂交瘤 细胞效果更好。在所述单克隆抗体制备中,使用小鼠脾脏强化免疫技术的融合率为96. 3%,阳 性率达到97%。本专利技术的目的还提供了一种抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白的单克隆抗体在鳜鱼弹状病毒感染的 免疫检测中的应用。本专利技术又一个目的是在于提f共了一种抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白的单克隆抗体在鳜鱼弹状病 毒糖蛋白在宿主的细胞中进行定量分析的应用。本专利技术再一个目的是在于提供了一种抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白的单克隆抗体在鳜鱼弹状病 毒糖蛋白在宿主的组织中进行定位分析的应用。为了实现上述目的,本专利技术采用以下技术方案本专利技术的所述单克隆抗体制备方法,是以纯化的鳜鱼弹状病毒为抗原,经免疫BALB/c小 鼠后,应用杂交瘤细胞融合技术,筛选鉴定出抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白的单克隆抗体,产生该 单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株SCRV-G-1B2,该杂交瘤细胞株已于2009年2月25日保藏 于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,地址中国武汉市武汉大学),保藏编号为CCTCC No: C200918。 一种抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白的单克隆抗体的制备方法,其步骤如下1. 小鼠免疫 . '免疫用小鼠为SPF级8周龄雌性BALB/c小鼠。每只小鼠以纯化鳜鱼弹状病毒(蛋白量为 IOO昭)进行腹腔注射,每两周一次共三次,第一次用弗氏完全佐剂乳化,第二、三次用弗氏 不完全佐剂乳化,第四次用不加佐剂的纯化鳜鱼弹状病毒(蛋白量为75吗)直接注射小鼠脾 脏进行强化免疫一次。3天后待融合,获得免疫小鼠,。2. 细胞融合无菌条件下取免疫小鼠的脾细胞,按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞5: l的比例用质量百分比 为50W的PEG4000进行融合,融合后的细胞铺于96孔细胞培养板中,置于37'C,体积百分比为 5呢的C02的培养箱中培养。静置培养3天后,用倒置显微镜逐日观察。3. 杂交瘤细胞的筛选与克隆融合细胞培养10天后,收取细胞培养上清,以纯化鳜鱼弹状病毒为抗原进行间接ELISA 检测。用有限稀释法对阳性株杂交瘤细胞进行单克隆化筛选,再经间接ELISA进行检测,经 过3次克隆后获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株(称为SCRV-G-IB2)。经倒置显微镜 观察显示,SCRV-G-1B2细胞浑圆透亮,形态均一,易于贴壁生长,通常按1:2传代培养,次日则可长满瓶;传代培养2-3夭,培养基由粉红色转变为橙黄或浅黄色,表明细胞生长旺盛; SCRV-G-1B2经在液氮中反复冻存、复苏或在体外连续传代2个月以上,均能稳定分泌单克隆 抗体。该杂交瘤细胞株已于2009年2月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称:CCTCC, 地址中国武汉市武汉大学),保藏编号为CCTCCNo: C200918。4. 单克隆抗体的制备取经腹腔注射液体石蜡预处理的BALB/c小鼠,腹腔注入小鼠杂交瘤细胞SCRV-G-1B2,诱 生腹水,7-IO天后收取腹水,离心,收集上清,即为腹水单克隆抗体。5. 单克隆抗体的特性鉴定以纯化鳜鱼弹状病毒为抗原用间接ELISA方法测定该单克隆抗体的腹水效价;用Sigma 公司的小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(Mouse mAb Isotyping Kit)鉴定该单克隆抗体Ig亚 型;以免疫印迹(Western blot)法鉴定该单克隆抗体与鳜鱼弹状病毒病毒蛋白的反应性和特 异性。所述的抗鱖鱼弹状病毒糖蛋白的单克隆抗体在鳜鱼弹状病毒感染的免疫检测中的应用, 可根据条件,利用不同的免疫方法,包括间接免疫荧光试验、免疫点杂交、抗原捕获ELISA 等,可对可疑病鱼样品或待检鱼进行早期检测,也可研发试剂盒,到养殖场或疫区对鱼群进 行测试。所述的抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白的单克隆抗体在鳜鱼弹状病毒糖蛋白在宿主的组织或细胞 中的定量和定位分析中的应用,可通过流式细胞仪和免疫组化染色法来进行检测。 本专利技术具有以下优点和效果1、 获抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白的单克隆抗体及分泌该单抗的杂交瘤细胞株SCRV-G-1B2。 SCRV-G-1B2细胞增殖后可制备本文档来自技高网
...

【技术保护点】
一种抗鳜鱼弹状病毒糖蛋白的单克隆抗体,其特征在于:杂交瘤细胞株SCRV-G-1B2,CCTCC No:C200918。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:张奇亚陈中元
申请(专利权)人:中国科学院水生生物研究所
类型:发明
国别省市:83[中国|武汉]

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1
相关领域技术
  • 暂无相关专利