一种高效快速抑制结缕草内源基因表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效快速抑制结缕草内源基因表达的方法。结缕草的遗传转化极为困难，严重制约了其基因功能研究和分子育种工作的开展。本发明专利技术公开的新方法利用农杆菌介导的水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体特异性地下调结缕草内源基因的表达，为研究结缕草的基因功能提供了高效快捷的技术手段。所述方法包括以下步骤：1）结缕草目的基因片段的克隆；2）病毒诱导基因沉默载体的构建；3）农杆菌浸染结缕草植株；4）基因表达丰度的分子检测。使用本方法可以成功使结缕草内源基因的表达降低30%以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种农杆菌介导的病毒诱导基因沉默技术用于高效快速抑制结缕草内源基因表达的方法，属于基因工程和生物

技术介绍
结缕草（ZoysiajaponicaL.）是禾本科画眉草亚科结缕草属的多年生植物，是世界公认的优良暖季型草坪草，具有广泛的土壤适应性、较强的抗性（抗寒性、抗旱性、耐盐性、抗病虫害等）和耐粗放管理、省水节肥等优良特性，被广泛用于暖温带和亚热带的公园绿化、高尔夫球场和体育场等各种草坪的建设，在草坪产业中具有十分重要的地位。对结缕草抗逆、发育相关重要基因进行功能研究能够为基因工程育种和分子辅助育种提供重要的候选基因和理论依据。然而目前所建立的农杆菌介导的结缕草遗传转化方法步骤繁琐且效率低下，严重阻碍了在结缕草植物体内进行目的基因功能的验证。病毒诱导的基因沉默技术利用病毒感染植物后植物对病毒RNA序列进行特异性识别和降解的机制，将目标基因序列融入病毒序列中，使感染重组病毒的植物体内病毒RNA和目标基因mRNA序列均被识别和降解，是一种高效抑制基因表达的技术方法。截至目前，已有多个病毒诱导基因沉默载体得到构建，成功用于水稻、二穗短柄草、高粱等禾本科植物的基因沉默实验，然而遗憾的是仍未有结缕草病毒诱导基因沉默技术的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高效快速抑制结缕草内源基因表达的方法，通过如下技术方案实现。（1）结缕草目的基因片段的克隆。在已知结缕草目的基因序列情况下，设计PCR扩增目的基因片段的上下游引物，设计原则保证PCR扩增产物长度大于100bp，同时在上下游引物5’端分别添加限制性内切酶MluI和PacI的识别碱基序列ACGCGT和TTAATTAA。提取结缕草RNA，逆转录成cDNA，使用高保真酶PCR扩增获得目的基因片段。电泳、切胶回收预期大小的PCR产物，连接平末端PCR产物克隆载体，转化大肠杆菌DH5α，涂布抗性平板，挑取克隆，用载体自带引物PCR鉴定获得阳性克隆后，测序确认PCR产物的正确性。在结缕草目的基因序列未知情况下，可以根据目的基因在其它物种的同源基因序列设计简并引物先从结缕草cDNA中PCR扩增获得部分基因序列，测序确认序列正确性后遵照上述方法获得目的基因片段。（2）病毒诱导基因沉默载体的构建。提取上述测序验证的含有结缕草目的基因片段的PCR产物克隆载体质粒和水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体pRTBV-MVIGS质粒，使用MluI和PacI两个限制性内切酶于37℃酶切8小时；电泳、切胶回收目的基因和pRTBV-MVIGS载体酶切片段，使用T4DNA连接酶将摩尔比为3：1的目的基因和pRTBV-MVIGS载体酶切回收片段进行连接，连接条件为16℃8小时；将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布卡那霉素抗性平板，挑取克隆，使用载体酶切位点两侧序列设计的引物RTBV-F（序列：GGATCCGGGCCCTTAATTA）和RTBV-R（序列：AGGCTGGAGGCATAAACGC）进行菌落PCR，对克隆进行鉴定。（3）农杆菌浸染结缕草植株。将连接结缕草目的基因片段的pRTBV-MVIGS质粒转化农杆菌EHA105，涂布卡那霉素和利福平双重抗性平板，挑取克隆，使用RTBV-F和RTBV-R引物进行菌落PCR检测。将PCR鉴定阳性克隆按1：100比例扩大培养于含卡那霉素和利福平的LB培养基，28℃培养过夜至OD600约为3。将培养液倒入离心管，4000g、4℃离心10分钟收集菌体。用浸染缓冲液（10mM吗啉乙磺酸，10mM氯化镁，7.5mM氯化钙，300mM乙酰丁香酮，pH5.6）重悬菌体，使OD600达到1.5，倒入烧杯中，室温静置3小时。将光照16小时/黑暗8小时、28℃条件下培养7天的结缕草幼苗从Hoagland培养基中取出，用清水洗去培养基，转移至含有农杆菌浸染液的烧杯中，用滤网盖住结缕草幼苗使其浸没于液面下。将烧杯放入连有真空泵的真空室中，抽真空5分钟后，将幼苗取出，用清水洗去粘附的浸染液，重新转移至Hoagland培养基中，于光照16小时/黑暗8小时、28℃条件继续培养21天。将含农杆菌的浸染废液用高温蒸汽灭菌后再予以丢弃。（4）基因表达丰度的分子检测。将未浸染的培养28天的结缕草植株以及浸染后继续培养21天的结缕草植株从Hoagland培养基中取出，剪下其叶片，提取其RNA，逆转录成cDNA。设计检测目的基因表达的PCR引物，避开第（1）步中PCR扩增目的基因区段，使用实时定量PCR获得目的基因在对照植株和浸染病变植株的Ct值。同时使用结缕草内参基因肌动蛋白（actin）的检测引物对内参基因actin在对照植株和浸染病变植株的表达量进行分析，获得响应的Ct值，用2–ΔΔCt算法计算获得目的基因在对照植株和浸染病变植株中相比actin基因的相对表达量。本专利技术的技术优势及有益效果在于。（1）相比耗时长且步骤繁琐的农杆菌介导的愈伤组织转化方法，本专利技术所提供的方法能够在4周内高效的将结缕草内源基因的表达进行抑制，通过观察基因表达被抑制植株相比对照植株的表型，可以快速地分析基因的功能。（2）相比已报道的农杆菌介导的病毒诱导基因沉默方法，本专利技术所提供的方法使用真空泵辅助农杆菌浸染结缕草叶片，相比注射器直接注射叶片提高了农杆菌浸染效率。在浸染液配方中，本专利技术提供的方法新加入了7.5mM的氯化钙，也极大的提高了浸染效率。（3）与结缕草cDNA文库相结合，使用本专利技术所提供的方法可以快速高通量地筛选与抗逆、生长发育相关的未知结缕草基因，为分子标记辅助育种和基因工程育种提供大量的候选基因。附图说明图1为结缕草两个品种八氢番茄红素脱氢酶基因表达被抑制的表型照片。图2为结缕草两个品种八氢番茄红素脱氢酶基因表达被抑制的定量PCR检测结果。具体实施方式下述实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1结缕草八氢番茄红素脱氢酶基因沉默导致植株叶片白化。国审结缕草品种‘兰引3号’结缕草和美国进口品种‘Crowne’结缕草：江苏省中国科学院植物研究所草业研究中心。pRTBV-MVIGS质粒：印度德里大学南方校区植物分子生物学系（参考文献：PurkayasthaA,MathurS,VermaV,SharmaS,DasguptaI.Virus-inducedgenesilencinginriceusingavectorderivedfromaDNAvirus.Planta,2010,232:1531-1540）。大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105：江苏省中国科学院植物研究所草业研究中心。一、结缕草八氢番茄红素脱氢酶基因（phytoenedesaturase,PDS）的克隆。使用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep植物总RNA提取试剂盒提取‘兰引3号’结缕草叶片的总RNA，操作步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效快速抑制结缕草内源基因表达的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）结缕草目的基因片段的克隆：提取结缕草RNA，逆转录成cDNA，通过PCR扩增获得目的基因序列，测序确认PCR扩增结果正确性；（2）病毒诱导基因沉默载体的构建：将结缕草目的基因片段和水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体进行酶切、连接、转化大肠杆菌，获得连入结缕草目的基因片段的病毒诱导基因沉默载体，挑取克隆、提取质粒、酶切验证克隆正确性；（3）农杆菌浸染结缕草植株：将连入结缕草目的基因片段的病毒诱导基因沉默载体转化农杆菌，将其扩大培养，使用浸染缓冲液重悬后真空辅助浸染结缕草植株；（4）基因表达丰度的分子检测：提取对照结缕草植株和农杆菌浸染植株RNA，逆转录成cDNA，使用定量PCR检测目的基因的表达丰度变化。

【技术特征摘要】
1.一种高效快速抑制结缕草内源基因表达的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）结缕草目的基因片段的克隆：提取结缕草RNA，逆转录成cDNA，通过PCR扩增获得目的基因序列，测序确认PCR扩增结果正确性；
（2）病毒诱导基因沉默载体的构建：将结缕草目的基因片段和水稻东格鲁杆状病毒基因沉默载体进行酶切、连接、转化大肠杆菌，获得连入结缕草目的基因片段的病毒诱导基因沉默载体，挑取克隆、提取质粒、酶切验证克隆正确性；
（3）农杆菌浸染结缕草植株：将连入结缕草目的基因片段的病毒诱导基因沉默载体转化农杆菌，将其扩大培养，使用浸染缓冲液重悬后真空辅助浸染结缕草植株；
（4）基因表达丰度的分子检测：提取对照结缕草植株和农杆菌浸染植株RNA，逆转录成cDNA，使用定量PCR检测目的基因的表达丰度变化。
2.权利要求1所述的方法，其步骤（1）所述扩增目的基因片段长度最小不能短于...

【专利技术属性】
技术研发人员：张兵，刘建秀，史经昂，郭海林，宗俊勤，陈静波，李丹丹，李建建，汪毅，郭爱桂，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32