一种TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞的制备方法及其用途技术

本发明专利技术属免疫学及肿瘤治疗学技术领域，涉及一种TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞的制备方法及其用途；本方法包括：将肿瘤抗原与未成熟的树突状细胞共孵育，获得特异性肿瘤抗原负载的成熟树突状细胞后与CD8+初始T细胞共培养，并加入干细胞分化抑制剂促进CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞产生；分离获得CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞；再克隆特异识别特定抗原表位的T细胞受体基因(TCR)，通过慢病毒包装或逆转录病毒载体共转染自体的CD8+Tscm细胞，体外制备不同肿瘤特定抗原特异性的CD8+TCR‑Tscm细胞。该方法制得的CD8+TCR‑Tscm细胞具有克服肿瘤异质性，特异性高，不良反应少的高效持久的防治肿瘤效果。

Preparation and use of a TCR gene modified CD8+T memory stem cell

The invention belongs to the technical field of immunology and tumor therapeutics, relates to a TCR gene modified CD8+T memory stem cell preparation method and application thereof; the method comprises the following steps: tumor antigen and immature dendritic cells were co incubated for load specific tumor antigen of mature dendritic cells after co cultured with CD8+ cells of initial T join, and stem cell differentiation inhibitor CD8+ promote stem cell like memory T lymphocytes; isolated CD8+ stem cell like memory T cell and T cell receptor gene cloning; specific identification of specific epitope (TCR), by lentivirus packaging or retroviral vectors were co transfected with autologous CD8+Tscm cells prepared in vitro different tumor specific antigen specific CD8+TCR Tscm cells. The prepared CD8+TCR Tscm cells have overcome tumor heterogeneity, high specificity, high durable tumor control effect with fewer side effects.

【技术实现步骤摘要】
一种TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞的制备方法及其用途
本专利技术属免疫学及肿瘤治疗学
，涉应用基因工程技术在体外制备CD8+T记忆性干细胞的方法，具体涉及一种TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞(TcellReceptor-Tmemorystemcell，CD8+TCR-Tscm)的制备方法及其用途；尤其是可识别多种肿瘤特异性抗原的TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞(TCR-Tscm)的体外制备方法及其在用于制备防治肿瘤制剂中的用途。
技术介绍
现有技术公开了恶性肿瘤属系统性疾病，是人体正常器官组织细胞在各种致病因素的作用下发生恶性改变，逃避免疫监视，打破免疫均衡，产生了免疫耐受，继而呈无限制生长的新生物。鉴于恶性肿瘤作为一种内源性疾病，手术、化疗、放疗及分子靶向治疗等外在干预性治疗措施还存在一定的局限性。随着肿瘤免疫学及分子生物学等学科的发展，通过调动或激发机体自身的免疫功能，从而抑制和杀伤肿瘤细胞的免疫治疗成为肿瘤治疗新的热点。自上世纪80年代以来，过继性细胞免疫治疗(AdoptiveCellTransfer,ACT)包括淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphok本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞的体外制备方法，其特征在于，其包括步骤：(1)将合成的肿瘤特异性抗原肽与未成熟的树突状细胞共孵育，获得特异性肿瘤抗原负载的成熟树突状细胞；(2)将步骤(1)获得的成熟树突状细胞与CD8+初始T细胞共培养，并加入干细胞分化抑制剂促进、产生肿瘤抗原特异性的特异肿瘤细胞的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞；(3)分离获得能特异性识别特异肿瘤细胞的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞；(4)从分离获得的特异性识别表达特定肿瘤抗原的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞中克隆特异识别特定抗原表位的T细胞受体(TCR)基因α链和β链；(5)用步骤(4)获得的识别特定抗原表位的...

【技术特征摘要】
1.一种TCR基因修饰的CD8+T记忆性干细胞的体外制备方法，其特征在于，其包括步骤：(1)将合成的肿瘤特异性抗原肽与未成熟的树突状细胞共孵育，获得特异性肿瘤抗原负载的成熟树突状细胞；(2)将步骤(1)获得的成熟树突状细胞与CD8+初始T细胞共培养，并加入干细胞分化抑制剂促进、产生肿瘤抗原特异性的特异肿瘤细胞的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞；(3)分离获得能特异性识别特异肿瘤细胞的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞；(4)从分离获得的特异性识别表达特定肿瘤抗原的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞中克隆特异识别特定抗原表位的T细胞受体(TCR)基因α链和β链；(5)用步骤(4)获得的识别特定抗原表位的TCR基因α链和β链，构建识别不同肿瘤特定抗原的TCR基因，通过慢病毒包装或逆转录病毒载体转染自体的CD8+Tscm细胞，体外制备不同肿瘤特定抗原特异性的CD8+TCR-Tscm细胞；(6)用CRISPR/Cas9基因敲除步骤(5)制备的抗原特异性的CD8+TCR-Tscm细胞一个或多个抑制性受体基因。2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤抗原为人工合成的特异性肿瘤抗原表位肽或者佐剂重组人钙网蛋白复合物；所述的肿瘤特异性抗原肽选自：NY-ESO-1,AFP,CEA,CA-125,MUC-1,ETA,MAGE,突变的Ras、Raf及突变的p53,以及肿瘤特异性突变抗原，如EGFR点突变T790M,G719X,L858R和缺失性突变。3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤抗原由肿瘤细胞在免疫原性细胞死亡诱导剂作用下释放。4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的未成熟的树突状细胞通过单个核细胞在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4的作用下诱导形成。5.按权利要求1所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴向华，邢凯琳，胡爱群，
申请(专利权)人：复旦大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：上海,31