制备具有优异的肽和蛋白结合性质的接枝共聚物赋形剂的方法技术

本文提供了一种制备半无规接枝共聚物的方法，其产物难以完全化学表征。本公开的产物具有以下独特且有用的性质：1)与肽结合；和2)在将该产物与肽共同给药到动物中时，与无本公开产物的单独的肽相比，该产物将延长血液循环时间并提高肽的水平。

A method of preparing graft copolymer excipients with excellent peptide and protein binding properties

In this paper, a method for the preparation of semi - random graft copolymer is provided, and its products are difficult to be completely chemically characterized. The products of the disclosure have the following unique and useful properties: 1) binding with peptides; and 2) when the product is combined with peptides into animals, the product will extend the blood circulation time and improve the peptide level compared with the single peptide without the open product.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备具有优异的肽和蛋白结合性质的接枝共聚物赋形剂的方法
技术介绍
针对生理活性肽和蛋白的新药制剂的开发集中于保持生物活性上，但即便这些也受肽和蛋白在体内固有地短的半衰期或不稳定性的限制。对于流体动力学直径小于约5nm的小肽和蛋白而言，情况尤其如此。长期以来人们一直希望通过使用不断地递送快速降解肽或蛋白药物的输注设备或通过在皮肤下提供药物的侵蚀性补给站来缓解肽和蛋白在体内的这种短半衰期或不稳定性。可延长肽和蛋白在体内和血液中的半衰期和/或提供肽和蛋白在体内和血液中的稳定性的赋形剂的开发是一个新的研究领域。夹带不稳定或短半衰期药物的脂质体依赖于药物可被释放之前脂质体结构的降解。聚乳酸-乙醇酸共聚物颗粒为另一夹带技术，其依赖于聚合物的酶降解以释放药物。已进行两种或更多种聚合物的半无规接枝，其产生将结合而不是夹带药物的共聚物(美国申请号11/613183、11/971482和Castillo等人的Pharm.Res.2012年第29卷(1)第306-318页)。这样的共聚物将提供所给药的肽和蛋白的血液稳定性、半衰期延长及长时间升高的血液水平(美国申请号11/613183、11/971482和Castillo等人的Pharm.Res.2012年第29卷(1)第306-318页)。然而，对接枝共聚物产物的制造方法和潜能(以重量为基础，结合肽的能力)加以改进的能力因不存在可确定其中两种聚合物接枝到另一聚合物和相对于彼此接枝的确切组织和周期性(如果有的话)的技术而受限制。看起来存在共聚物分子的组分的组织的方法诱导决定因素，其然后限定最终的共聚物产物组成和性质。由于最终产物的组成组织不能使用现有技术来评价，故产物仅可由用来制造所述产物的方法以及将所述产物与用相似但不相同的方法制得的其他产物区分开来的产物相关性质一起来限定。因为缺乏阐明产物原子组织的分析技术并且各种方法对实验的依赖和对最终产物的潜能的评价可能需要多年的详细试错实验，故制得优异产物的此类方法的确定并不明显。最终产物的组成差异只能通过它们的潜能来确定，潜能可由它们的制造方法限定。这是因为聚合物大，共聚反应是无规的，并且随着反应的进行，被接枝的聚合物的构象可能改变，导致由反应时间线的任何给定时刻下的构象决定的非无规分布。对于聚赖氨酸，构象的改变尤其如此，取决于环境，聚赖氨酸已知将从α螺旋改变为无规卷曲再改变为β折叠，反之亦然(Arunkumar等人，1997年，Int.J.Biol.Macromol.，第21卷(3):第223-230页)。构象也可能受其他试剂的影响(Mirtic和Grdadolnik，2013年，Biophys.Chem.175-176，第47-53页)并潜在地可能受催化剂的影响。这些影响可保持动态，直至反应终止。先前合成的聚合物的一些实例将在下文描述。美国申请号11/613183的实施例6描述了通过使用MPEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯或预活化N-羟基琥珀酰亚胺基聚乙二醇(NHS-PEG)来使聚赖氨酸饱和至22％的由甲氧基聚(乙二醇)(MPEG)达到22％饱和的聚赖氨酸，其与使用用NHSS(N-羟基琥珀酰亚胺硫酸盐)和EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)新活化的MPEG-羧基来制备溶液B的本公开(参见下文)实质上不同，本公开产生饱和至50-60％的聚赖氨酸。另外，美国申请号11/613183的实施例6通过在纯化后用月桂酸饱和剩余的伯氨基而在所述产物22％饱和的基础上改性了0.0228mmol(20mg)伯氨基等价物或0.104mmol初始伯氨基。饱和的过程使用等价于初始伯氨基的2.4倍摩尔的月桂酸，所述月桂酸经用等价于初始伯氨基的1.1倍摩尔的NHSS和等价于初始伯氨基的5倍摩尔的EDC活化。因此，基于所用试剂及其比率，与本公开(参见下文)相比，美国申请号11/613183的实施例6为完全不同的方法。基于可通过分析测量的方面如使用三硝基苯磺酸(TNBS)测定伯氨基基团给出仅22％的PEG饱和度，产物也是完全不同的产物。美国申请号11/613183的实施例7描述了通过使用MPEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯或预活化NHS-PEG来使聚赖氨酸饱和至22％的由MPEG达到22％饱和的聚赖氨酸，其与使用用NHSS和EDC新活化的MPEG-羧基(溶液B)来产生饱和至50-60％的聚赖氨酸的本公开(参见下文)实质上不同。另外，美国申请号11/613183的实施例7通过在纯化后用硬脂酸饱和剩余的伯氨基而在所述产物22％饱和的基础上改性了0.0228mmol(20mg)伯氨基等价物或0.104mmol初始伯氨基。饱和的过程使用等价于初始伯氨基的1.71倍摩尔的硬脂酸，所述硬脂酸经用等价于初始伯氨基的1.1倍摩尔的NHSS和等价于初始伯氨基的5倍摩尔的EDC活化。因此，基于所用试剂及其比率，与本公开(参见下文)相比，美国申请号11/613183的实施例7为完全不同的方法。基于可通过分析测量的方面如TNBS给出仅22％的PEG饱和度，产物也是完全不同的产物。美国申请号11/613183的实施例8描述了通过使用MPEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯或预活化NHS-PEG来使聚赖氨酸饱和至22％的由MPEG达到22％饱和的聚赖氨酸，其与使用用NHSS和EDC新活化的MPEG-羧基(溶液B)来产生饱和至50-60％的聚赖氨酸的本公开(参见下文)实质上不同。另外，美国申请号11/613183的实施例8通过在纯化后用辛酸饱和剩余的伯氨基而在所述产物22％饱和的基础上改性了0.0228mmol(20mg)伯氨基等价物或0.104mmol初始伯氨基。饱和的过程使用等价于初始伯氨基的3.36倍摩尔的辛酸，所述辛酸经用等价于初始伯氨基的1.1倍摩尔的NHSS和等价于初始伯氨基的5倍摩尔的EDC活化。因此，基于所用试剂及其比率，与本公开(参见下文)相比，美国申请号11/613183的实施例8为完全不同的方法。基于可通过分析测量的方面如TNBS给出仅22％的PEG饱和度，产物也是完全不同的产物。美国申请号11/613183的实施例9描述了通过使用MPEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯或预活化NHS-PEG来使聚赖氨酸饱和至55％的由MPEG达到55％饱和的聚赖氨酸，其与使用用NHSS和EDC新活化的MPEG-羧基(溶液B)来产生饱和至50-60％的聚赖氨酸的本公开(参见下文)实质上不同。另外，美国申请号11/613183的实施例9通过在纯化后用月桂酸饱和聚赖氨酸-聚乙二醇(PLPEG)产物的剩余伯氨基而在所述PLPEG产物55％饱和的基础上改性了0.0318mmol(40mg)PLPEG伯氨基等价物或0.450mmol初始伯氨基。饱和的过程使用等价于初始伯氨基的1.8倍摩尔的月桂酸，所述月桂酸经用等价于初始伯氨基的0.34倍摩尔的NHSS和等价于初始伯氨基的1.16倍摩尔的EDC活化。因此，基于所用试剂及其比率，与本公开(参见下文)相比，美国申请号11/613183的实施例9为完全不同的方法。基于月桂酸或C12的存在，产物也是完全不同的产物。美国申请号11/613183的实施例12使用1g聚赖氨酸来制备溶液A。将MPEG-琥珀酸酯(5g，初始伯氨基的0.59倍摩尔当量)用250m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备半无规接枝共聚物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将含有W摩尔游离伯氨基基团的线形多胺骨架溶解于缓冲范围为pH 7至pH 8的水性缓冲剂中以获得具有体积Y的溶液A；进行步骤B1或步骤B2，其中：步骤B1包括：(b)通过将含有0.5‑1.2xW羧基基团的保护链与1.7‑7.0xW的N‑羟基琥珀酰亚胺硫酸盐(NHSS)和1.5‑3.6xW的1‑乙基‑3‑[3‑二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)在pH 4‑5.5的水性缓冲剂中混合来活化所述保护链以获得最终体积为Z的溶液B，使得W/(Y+Z)＝30‑55mM，并让所述活化进行0‑30分钟以获得溶液B；(c)向溶液A中加入溶液B以产生溶液C；(d)调节溶液C的pH至高于6.5；和步骤B2包括：(b‑d)向溶液A中加入含有0.5‑1.2xW羧基基团的保护链、1.7‑7.0xW的N‑羟基琥珀酰亚胺硫酸盐(NHSS)和1.5‑3.6xW的1‑乙基‑3‑[3‑二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)以获得溶液C；和(e)2至3小时后向溶液C中加入0.5‑1.5xW的额外的1‑乙基‑3‑[3‑二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)并等待直至剩余的伯氨基基团为初始伯氨基的55‑40％(45至60％饱和)。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.03 US 62/074,3561.一种制备半无规接枝共聚物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将含有W摩尔游离伯氨基基团的线形多胺骨架溶解于缓冲范围为pH7至pH8的水性缓冲剂中以获得具有体积Y的溶液A；进行步骤B1或步骤B2，其中：步骤B1包括：(b)通过将含有0.5-1.2xW羧基基团的保护链与1.7-7.0xW的N-羟基琥珀酰亚胺硫酸盐(NHSS)和1.5-3.6xW的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)在pH4-5.5的水性缓冲剂中混合来活化所述保护链以获得最终体积为Z的溶液B，使得W/(Y+Z)＝30-55mM，并让所述活化进行0-30分钟以获得溶液B；(c)向溶液A中加入溶液B以产生溶液C；(d)调节溶液C的pH至高于6.5；和步骤B2包括：(b-d)向溶液A中加入含有0.5-1.2xW羧基基团的保护链、1.7-7.0xW的N-羟基琥珀酰亚胺硫酸盐(NHSS)和1.5-3.6xW的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)以获得溶液C；和(e)2至3小时后向溶液C中加入0.5-1.5xW的额外的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)并等待直至剩余的伯氨基基团为初始伯氨基的55-40％(45至60％饱和)。2.根据权利要求1所述的制备半无规接枝共聚物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将含有W的游离伯氨基基团的线形多胺骨架溶解于缓冲范围包括pH7-8的水性缓冲剂中以获得具有体积Y的溶液A；(b)通过将含有0.5-1.2xW羧基基团的保护链与1.7-7.0xW的N-羟基琥珀酰亚胺硫酸盐(NHSS)和1.5-3.6xW的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)在pH4-5.5的水性缓冲剂中混合来活化所述保护链以获得最终体积为Z的溶液B，使得W/(Y+Z)＝30-55mM，并让所述活化进行0-30分钟以获得溶液B；(c)在连续混合下向溶液A中加入溶液B，产生溶液C；(d)调节溶液C的pH至高于6.5；和(e)1-3小时后向溶液C中加入0.5-1.5xW的额外的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)并等待直至剩余的伯氨基基团为初始伯氨基的55-40％(45至60％饱和)。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，所述方法还包括以下步骤：(f)当剩余的伯氨基基团为初始伯氨基的55-40％时冷冻和冻干溶液C，并在一种或多种有机溶剂中复原所述冻干材料以获得溶液D；(g)向溶液D中加入0.5-6xW的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)或其他叔胺；和(h)加入至少0.75xW当量的长链脂肪酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)以获得溶液E，并于室温下搅拌所述溶液至少2小时或直至剩余的伯氨基基团少于初始伯氨基的5％以获得粗的最终产物。4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，所述方法还包括以下步骤：(f)向溶液C中加入至少W的强亲核试剂如羟胺并通过超滤然后冻干来纯化所述产物，并且将所述产物溶解于乙腈中以获得溶液D；(g)向溶液D中加入0.5-6xW的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)或其他叔胺；(h)加入至少0.75xW当量的长链脂肪酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)以获得溶液E，并于室温下搅拌溶液E至少2小时直至剩余的伯氨基基团少于初始伯氨基的5％以获得粗的最终产物。5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，所述方法还包括以下步骤：(f)当剩余的伯氨基基团为初始氨基的55-40％时，通过添加1.0-2.5体积当量的乙腈来增加溶液C的总体积以获得溶液D，并加热溶液D到40-70℃达至少10分钟，加入强亲核试剂，然后通过超滤和冻干来纯化甲氧基聚乙二醇接枝聚赖氨酸(PLPEG)产物；和用纯甲氧基聚乙二醇接枝聚赖氨酸(PLPEG)产物在66％乙腈中复原溶液D；(g)向溶液D中加入0.5-6xW的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)或其他叔胺；和(h)加入至少0.75xW当量在40-70℃乙腈中的长链脂肪酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)以获得溶液E，并于室温下搅拌溶液E至少2小时或直至剩余的伯氨基基团少于初始伯氨基的5％以获得粗的最终产物。6.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，所述方法还包括以下步骤：(f)当剩余的伯氨基基团为初始氨基的55-40％时，通过添加1.0-2.5体积当量的乙腈来增加溶液C的总体积以获得溶液D，并加热溶液D到40-70℃，包括40℃和70℃；(g)向溶液D中加入0.5-6xW的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)或其他叔胺；和(h)加入至少0.75xW当量在40-70℃乙腈中的长链脂肪酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)以获得溶液E，并于室温下搅拌溶液E至少2小时或直至剩余的伯氨基基团少于初始伯氨基的5％以获得粗的最终产物。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述线形多胺骨架为基于光散射或核磁共振分析具有35-150的聚合度的聚赖氨酸；其中保护链为具有单个羧基端并且基于凝胶渗透色谱法具有4-12kDa的数均分子量或Mn的甲氧基聚乙二醇(MPEG)链；和其中当存在时，长链脂肪酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)为硬脂酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(C18-NHS)。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中聚赖氨酸的聚合度基于光散射或核磁共振分析为35-85；其中PEG保护链基于凝胶渗透色谱法具有4-6kDa的数均分子量或Mn。9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中在步骤“e”中，向溶液C中加入0.5-1.2xW的额外的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐EDC；和其中当步骤“f”存在时，在步骤“f”中，当剩余的伯氨基基团达到初始伯氨基的55-40％时加入1.5-2.0体积C当量的乙腈。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在步骤“b”中溶液B具有0.5-1.1xW的羧基基团、1.7-3.7xW的N-羟基琥珀酰亚胺硫酸盐(NHSS)、1.5-3.3xW的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)；其中在步骤“e”中，向溶液C中加入0.5-1.1xW的额外的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在步骤“b”中溶液B具有0.5-1.0xW的羧基基团、1.7-3.4xW的N-羟基琥珀酰亚胺硫酸盐(NHSS)和1.5-3.0xW的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)；其中在步骤“e”中，向溶液C中加入0.5-1.0xW的额外的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中步...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·C·约内斯，J·F·阿尔法罗，G·M·卡斯蒂洛，
申请(专利权)人：药明公司，
类型：发明
国别省市：美国,US