硫酸乙酰肝素的PDGF‑B/PDGF‑BB结合变体制造技术

本发明专利技术公开了源自猪粘膜血小板衍生生长因子结合的硫酸乙酰肝素(HS6)的亲和纯化。还公开了HS6在皮肤修复和再生中的应用用于治疗伤口、烧伤、溃疡和其它皮肤损伤。

Heparan sulfate PDGF B/PDGF BB combined with variant

The invention discloses the affinity purification of heparin sulfate (HS6) derived from the binding of platelet-derived growth factor in pig mucous membrane. The application of HS6 in skin repair and regeneration is also disclosed for the treatment of wounds, burns, ulcers and other skin injuries.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】硫酸乙酰肝素的PDGF-B/PDGF-BB结合变体专利
本专利技术涉及结合PDGF-B或PDGF-BB的硫酸乙酰肝素，且涉及其在创伤愈合中的应用，包括皮肤修复和/或再生。
技术介绍
皮肤构成人体最大的器官，作为保护屏障抵挡人身伤害，辐射和温度。皮肤由在下面的间质(真皮)层和外部上皮(表皮)层组成。皮肤伤口愈合由各种机制调节，包括细胞-细胞相互作用，细胞外基质产生和许多细胞因子和生长因子(见PaulMartin.伤口愈合-旨在完美的皮肤再生“WoundHealing-AimingforPerfectSkinRegeneration”.Science276(75)1997)。伤口治疗的重要目的包括快速伤口闭合以及在功能和美观上令人满意的瘢痕。皮肤的伤口愈合通过诸多事件的重叠模式进行，包括凝血，炎症，组织形成(上皮形成，肉芽组织形成和基质形成)和组织重塑。PDGFBB与炎症，肉芽发生，组织形成，再上皮化，基质形成和重塑过程有关。修复过程在很大程度上是通过相互作用的分子信号，主要是细胞因子介导。初始损伤引发凝血和急性局部炎症反应，随后是间充质干细胞募集，增殖和基质合成。不能解决炎症可导致慢性非愈合伤口，而不受控制的基质积累可导致过度瘢痕形成。已知对伤口愈合至关重要的主要生长因子之一是血小板衍生生长因子(PDGF)，其是由许多类型的细胞生成的肝素结合蛋白家族，包括血小板，巨噬细胞，平滑肌和内皮细胞。PDGF-BB(PDGF-B的同型二聚体)变体是食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗非愈合性糖尿病性溃疡的唯一生长因子。然而，过度使用PDGF-BB与癌症风险增加有关。糖胺聚糖是与多种蛋白质相互作用以调节其功能的复杂，线性，高电荷的碳水化合物；它们通常被合成附着于核心蛋白质。GAG分为非硫酸化(HA)和硫酸化(CS，DS，KS，肝素和HS)。在GAG中，硫酸乙酰肝素(HS)家族是特别感兴趣的，因为其能够基于其结构域内的特定序列与靶向蛋白质相互作用。家族(肝素和HS)由具有可变模式的N-和O-硫酸化的重复的糖醛酸-(1→4)-D-葡糖胺二糖亚基组成。例如，肝素的抗凝血活性需要用独特的五糖排列在葡萄糖胺残留中进行3O-硫酸化(LindahlU,BackstromG,HookM,ThunbergL,FranssonLA,LinkerA.肝素中抗凝血酶结合位点的结构Structureoftheantithrombin-bindingsiteinheparin.ProcNatlAcadSciUSA.1979；76:3198-202.)。独特的硫酸化模式对于ECM蛋白也是显而易见的；结合FN的易感肝素结合变体特别高度带电，需要7至8个N-硫酸化二糖，并且具有比常规更大的结构域(>14个残基)(FalconeDJ，SalisburyBGJ.纤连蛋白刺激巨噬细胞摄取低密度脂蛋白-肝素-胶原复合物。Arteriosclerosis.1988；8：263-73；MahalingamY，GallagherJT，CouchmanJR。对纤连蛋白的肝素结合(Hepll)结构域的细胞粘附反应需要具有特定性质的硫酸乙酰肝素。JBiolChem.2007；282：3221-30)。然而，HS通过具有由未硫酸化的NA结构域分离的高度硫酸化的NS结构域而不同于这种硫酸化肝素；这种情况提供选择性结合蛋白质的独特排列，而没有肝素的副作用(GandhiNS,ManceraRL.糖胺聚糖的结构及其与蛋白质的相互作用TheStructureofGlycosaminoglycansandtheirInteractionswithProteins.ChemBiolDrugDes.2008；72：455-82)。HS的二糖组成可以通过一系列酶裂解来阐明(VenkataramanG，ShriverZ，RamanR，SasisekharanR.测序复合多糖“Sequencingcomplexpolysaccharides”.科学.1999；286：537-42；DesaiUR，WangHM，LinhardtRJ。肝素黄杆菌肝素裂解酶的特异性研究“SpecificitystudiesontheheparinlyasesfromFlavobacterium-heparinum”.Biochemistry.1993；32：8140-5；ShriverZ，SundaramM，VenkataramanG，FareedJ，LinhardtR，BiemannK等人.通过肝素酶切割肝素中的抗凝血酶III结合位点及其在产生低分子肝素中的作用“CleavageoftheantithrombinIIIbindingsiteinheparinbyheparinasesanditsimplicationinthegenerationoflowmolecularweightheparin”.ProcNatlAcadSciU.S.2000；97：10365-70)，其使用肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinium)酶肝素酶I，II和III切割糖苷键。当所有3种肝素酶组合使用时，肝素或HS的解聚可能超过90％(KaramanosNK，VankyP，TzanakakisGN，TsegenidisT，HjerpeA.离子对高效液相色谱法测定肝素和硫酸乙酰肝素中的二糖组成“Ion-pairhigh-performanceliquidchromatographyfordeterminingdisaccharidecompositioninheparinandheparansulphate”.JChromatogrA.1997；765：169-79；VyniosDH，KaramanosNK，TsiganosCP.糖胺聚糖分析进展：其用于评估结缔组织生理和病理状态“Advancesinanalysisofglycosaminoglycans:itsapplicationfortheassessmentofphysiologicalandpathologicalstatesofconnectivetissues”.JChromatogrB.2002；781：21-38)。所得二糖混合物可以通过与已知二糖标准物进行比较采用PAGE(HampsonIN,GallagherJT.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离放射性标记的糖胺聚糖寡糖“Separationofradiolabeledglycosaminoglycanoligosaccharidesbypolyacrylamide-gelelectrophoresis”.BiochemJ.1984；221:697-705)、SAX-HPLC(SkidmoreMAA,YatesE和TurnbullJE.用HPLC和MS分离用发色团，荧光和质量标签标记硫酸乙酰肝素糖“Labellingheparansulfatesaccharideswithchromophore,fluorescenceandmasstagforHPLCandMSseparations”.MethodsinMolecularbiology.2009；534:157-69)本文档来自技高网...

【技术保护点】
硫酸乙酰肝素HS6。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.09 SG 10201500182X1.硫酸乙酰肝素HS6。2.分离的或基本纯化形式的硫酸乙酰肝素HS6。3.如权利要求1或2所述的硫酸乙酰肝素HS6，其特征在于，所述HS6能够与具有下列氨基酸序列、或由该序列组成的肽或多肽结合：RAKTPQTRVTIRTVRVRRPPKGKHRKFKHTHDK(SEQIDNO:1)。4.如权利要求1至3中任一项所述的分离的或基本纯化的硫酸乙酰肝素HS6，其特征在于，在用肝素裂解酶I、II和III消化，然后将所得二糖片段进行HPLC分析之后，所述硫酸乙酰肝素HS6具有包含以下的二糖组成：5.如权利要求1至3中任一项所述的分离的或基本纯化的硫酸乙酰肝素HS6，其特征在于，在用肝素裂解酶I、II和III消化，然后将所得二糖片段进行HPLC分析之后，所述硫酸乙酰肝素HS6具有包含以下的二糖组成：6.如权利要求1至5中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS6、或分离的或基本上纯化形式的硫酸乙酰肝素HS6，通过包括以下步骤的方法获得：(i)提供固体支持物，所述固体支持物具有附着于其上的多肽分子，其中所述多肽包含具有氨基酸序列RAKTPQTRVTIRTVRVRRPPKGKHRKFKHTHDK的肝素结合结构域；(ii)使所述固体支持物与包含糖胺聚糖的混合物优选为硫酸乙酰肝素制剂接触，从而形成多肽-糖胺聚糖复合物；(iii)使所述多肽-糖胺聚糖复合物与混合物的剩余部分分离；(iv)使糖胺聚糖优选硫酸乙酰肝素类从所述多肽-糖胺聚糖复合物解离；(v)收集解离的糖胺聚糖，优选一种或多种硫酸乙酰肝素类。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多肽具有选自以下的氨基酸序列、或由该氨基酸序列组成：RAKTPQTRVTIRTVRVRRPPKGKHRKFKHTHDK(SEQIDNO：1)。8.权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述包含糖胺聚糖的混合物是从猪粘膜获得的硫酸乙酰肝素制剂(HSPM)。9.一种含有如权利要求1至8任一项所述的硫酸乙酰肝素HS6的组合物。10.如权利要求9所述的组合物，还包括生长因子，优选PDGF-B或PDGF-BB。11.一种含有如权利要求1至8任一项所述的硫酸乙酰肝素HS6的药物组合物或药物。12.如权利要求11所述的药物组合物或药物，其特征在于，所述药物组合物或药物还包含PDGF-B或PDGF-BB或包含PDGF-B的异二聚体。13.如权利要求11或12所述的药物组合物或药物，用于医学治疗方法中。14.如权利要求1至8任一项所述的硫酸乙酰肝素HS6，用于医学治疗方法中。15.如权利要求14所述的硫酸乙酰肝素HS6，其特征在于，所述的医学治疗方法包括体内伤口愈合的方法。16.如权利要求14所述的硫酸乙酰肝素HS6，其特征在于，所述的医学治疗方法包括组织的修复和/或再生。17.如权利要求1至8中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS6在制备用于治疗组织损伤、疾病或病症的药物中的用途，其中所述方法涉及组织的修复和/或再生。18.一种治疗患者组织损伤、疾病或病症的方法，所述方法包括给患者施用治疗有效量的如权利要求1至8中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS6，从而导致组织修复和/或再生。19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法包括向需要再生或修复组织的患者身体上的伤口或位置处或周围的组织施用硫酸乙酰肝素HS6。20.如权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给患者施用PDGF-B或PDGF-BB或包含PDGF-B的异二聚体。21.一种治疗患者组织损伤、疾病或病症的方法，所述方法包括将生物相容性植入物或假体在疾病、病症或损伤处或周围手术植入患者的组织中从而导致所述组织的修复和/或再生，所述植入物或假体包含生物材料和如权利要求1至8中任一项所述的硫酸乙酰肝素HS6。22....

【专利技术属性】
技术研发人员：S·库尔，V·纳库姆，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡,SG