硫酸乙酰肝素用于皮肤修复和/或再生制造技术

本发明专利技术公开了从猪粘膜(HS8)亲和纯化成纤维细胞生长因子‑2结合性的硫酸乙酰肝素。还公开了HS8在用于治疗伤口、烧伤、溃疡和其他皮肤损伤的皮肤修复和再生中的应用。

Heparan sulfate for skin repair and / or regeneration

The present invention discloses from porcine mucosa (HS8) affinity purification of fibroblast growth factor 2 binding heparan sulfate. The use of HS8 in the repair and regeneration of wounds, burns, ulcers, and other skin lesions is also disclosed.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】硫酸乙酰肝素用于皮肤修复和/或再生专利
本专利技术涉及硫酸乙酰肝素，其包括结合FGF2的硫酸乙酰肝素，特别涉及其在皮肤修复和/或再生中的治疗用途，但不限于此。
技术介绍
皮肤构成人体最大的器官，作为保护屏障抵挡人身伤害，辐射和温度。皮肤由在下面的间质(真皮)层和外部上皮(表皮)层组成。皮肤伤口愈合由各种机制调节，包括细胞-细胞相互作用，细胞外基质产生和许多细胞因子和生长因子(见PaulMartin.伤口愈合-旨在完美的皮肤再生“WoundHealing-AimingforPerfectSkinRegeneration”.Science276(75)1997)。伤口治疗的重要目的包括快速伤口闭合以及在功能和美观上令人满意的瘢痕。皮肤的伤口愈合通过诸多事件的重叠模式进行，包括凝血，炎症，组织形成(上皮形成，肉芽组织形成和基质形成)和组织重塑。修复过程在很大程度上是通过相互作用的分子信号，主要是细胞因子介导的。初始损伤引发凝血和急性局部炎症反应，随后是间充质干细胞募集，增殖和基质合成。不能解决炎症可导致慢性非愈合伤口，而不受控制的基质积累可导致过度瘢痕形成。已知对皮肤伤口愈合至关重要的主要生长因子之一是成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)，其属于由包括成纤维细胞，黑素细胞，内皮细胞在内的许多类型细胞，特别是干细胞生成的类肝素结合蛋白家族。FGF-2在多种发育和生物过程中起作用，包括肢体发育，组织修复，中胚层诱导，肺发育和维持神经元存活；特别地，FGF-2调节细胞增殖，迁移和分化，包括真皮和表皮。FGF-2变体已获得食品和药物管理局(FDA)批准用于数个III期临床试验，包括外周血管生成。FGF-2对角质形成细胞具有增殖和运动两种作用，并且增强皮肤衍生的间充质干细胞的活性。FGF-2也是原癌基因，使其在高浓度下的使用成为问题，因此需要替代疗法。FGF-2在伤口愈合过程中对角质形成细胞具有增殖和运动作用，并增加皮肤衍生的间充质干细胞。FGF-2治疗对于被辐射的皮肤的修复是有效的。其用作二度烧伤创面的局部治疗也已被评估，其中确定了伤口愈合明显更快以及最大瘢痕延伸更大，瘢痕缩回至最大瘢痕延伸率和弹性。还通过诱导肌成纤维细胞凋亡来支持无疤痕伤口愈合，但对成纤维细胞具有相同的作用。再上皮化是人类皮肤伤口愈合中的关键事件，其中表皮角化细胞从旁迁移以闭合伤口。在慢性伤口中，角质形成细胞迁移被阻止，伤口保持开放，导致患者发病，甚至死亡。在人类皮肤伤口愈合期间，重要的步骤是在伤口边缘引起表皮和真皮细胞迁移到伤口床。人角质形成细胞(HKC)从切割边自侧面迁移穿过伤口床，以最终闭合伤口(再上皮化)。真皮细胞，包括真皮成纤维细胞(DF)和真皮微血管内皮细胞(HDMEC)，在HKC迁移后移入伤口，在此这些细胞沉积基质蛋白质，收缩和改造新近闭合的伤口并建立新的血管。Brickman等(糖生物学“Glycobiology”，卷8，第463-471页，1998年)描述称为HS2的硫酸乙酰肝素能够与FGF2相互作用。如Brickman(同上)所述，可以从10天胎龄的鼠细胞的乙酰肝素蛋白聚糖获得。HS2已被描述为具有分子量约25kDa，因此，假设每个二糖平均分子质量400Da，由约60个二糖组成。HS2的二糖组成列于Brickman等(糖生物学“Glycobiology”，卷8，第463-471页，1998年)、WO2010/01185，其全部内容通过引用并入本文。HS2的亚硝酸和乙酰肝素裂解酶消化曲线如图29和30所示。Maccarana等(碱性成纤维细胞生长因子结合所需的硫酸乙酰肝素/肝素中的最小序列“MinimalSequenceinHeparin/HeparanSulfateRequiredforBindingofBasicFibroblastGrowthFactor”.生物化学学报.卷268,32号,15期,23898-23905页,1993)描述研究由人主动脉肝素或HS产生的几种小寡糖结合FGF-2的实验。使用一个八糖部分(B2)归为八糖的结构，作者称之为HS-8。应当注意，这不是本专利技术的HS-8，并且命名完全是巧合。来自猪肠粘膜的肝素，选择性O-脱硫肝素的两个样品，其中一个样本通过原料的优先6-O-脱硫和N-脱硫然后再N-硫化获得，另一个样本在碱性条件下通过选择性2-O-脱硫获得，从人主动脉分离的低硫酸化HS和来自牛肾的HS用于产生偶数或奇数的低链长寡糖。通过用亚硝酸进行部分脱氨裂解解聚由肝素产生偶数寡糖，并且所得到的2,4-脱水-D-甘露糖残基用NAB3H4还原。分离标记的寡糖以产生来自4-14个糖的偶数物质和含有20-24个糖的组分。类似处理选择性6-O-脱硫肝素以获得4-至12-糖。分离和脱盐的寡糖进行轻度酸处理。用肝素酶I进一步处理20-24-聚糖获得奇数肝素寡糖。4-14-聚低聚糖通过不同的策略从人主动脉HS产生，涉及在N-乙酰化GlcN单位占据的部位进行切割。样品经N-脱乙酰化，然后用亚硝酸脱氨。这种处理导致未取代的GlcN单元脱氨和氨基糖胺键的切割，而N-硫酸化GlcN单元保持完整。产品包括GlcA-[1-3H]aManR二糖(衍生自(-GlcNAc)-(GlcA-GlcNac)n-序列)和GlcA-GlcNSO3-HexA)n-[1-3H]aManR寡糖(衍生自(-GlcNac)-GlcA-(GlcNSO3-HexA)n-GlcNac-序列)。通过这些处理产生的寡糖都是短的和经它们的制备方法化学修饰，该方法将它们与本专利技术的HS区分开。
技术实现思路
本专利技术涉及一种硫酸乙酰肝素制剂，硫酸乙酰肝素HS8。已经发现HS8结合FGF2并增强干细胞的增殖，同时保持它们的多能性/多潜能性。HS8是指一类新型的结构和功能相关的分离的硫酸乙酰肝素。本专利技术人已经鉴定了HS8类的几个密切相关的成员，这些成员具有结合衍生自FGF2的肝素结合域的共同特性并且共享短共有序列(YCKNGGF)。HS8类成员能够刺激干细胞的增殖并富集集落形成单位。在本专利技术的一个方面，提供硫酸乙酰肝素HS8。HS8可以以分离的形式或基本上纯化的形式提供。这可以包括提供组合物，其中硫酸乙酰肝素组分为至少80％HS8，更优选至少85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。在优选的实施方式中，HS8能够结合具有YCKNGGF(SEQIDNO：2)的氨基酸序列的肽或多肽。该肽可以在该序列的一端或两端具有一个或多个另外的氨基酸。例如，肽可以在该序列的一端或两端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多的氨基酸。在一些实施方式中，HS8能够结合具有以下任何一个氨基酸序列或由其组成的肽或多肽：·YCKNGGF(SEQIDNO：2)，或·GHFKDPKRLYCKNGGF(SEQIDNO：1)。在其它实施方式中，多肽是FGF2蛋白。在一些实施方式中，HS8结合具有SEQIDNO：1或2中任何一个氨基酸序列或由其组成的肽或结合FGF2蛋白，KD小于100μM，更优选小于50μM、40μM、30μM、20μM或10μM。可以根据本文所述的专利技术人的方法获得，鉴定，分离或富集HS8，其可以包括以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
硫酸肝素HS8用于皮肤修复和/或再生的治疗方法。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.11.19 SG 10201408007P1.硫酸肝素HS8用于皮肤修复和/或再生的治疗方法。2.硫酸肝素HS8在制备用于皮肤修复和/或再生的治疗方法的药物的用途。3.权利要求1所述的HS8用于皮肤修复和/或再生的治疗方法或权利要求2所述的用途，其特征在于，所述治疗方法包括治疗皮肤伤口或瘢痕，任选地选自皮肤烧伤、溃疡、切除伤口、刺伤或穿刺伤口。4.权利要求1所述的HS8用于皮肤修复和/或再生的治疗方法或权利要求2所述的用途，其特征在于，所述治疗方法包括皮肤移植愈合，皮肤重建或皮肤整形手术。5.一种治愈皮肤伤口的方法，包括使皮肤伤口接触有效量的包含硫酸乙酰肝素HS8的药物组合物。6.一种治疗具有皮肤伤口的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的硫酸乙酰肝素HS8，导致伤口处皮肤修复和/或再生。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述皮肤伤口是皮肤烧伤、溃疡、切除伤口、切割，刺伤或穿刺伤口。8.一种皮肤移植、皮肤重建或皮肤整形手术的方法，包括在移植、重建或整形手术区域或其附近皮肤与有效量的包含HS8的药物组合物接触。9.前述权利要求中任一项所述的HS8用于皮肤修复和/或再生的治疗方法、用途或方法，其特征在于，所述HS8、药物或药物组合物被配制用于局部或透皮给药。10.前述权利要求中任一项所述的HS8用于皮肤修复和/或再生的治疗方法、用途或方法，其特征在于，所述HS8、药物或药物组合物配制为凝胶、喷雾剂、糊剂、膏剂、霜剂、洗剂、油膏、油、水溶液、悬浮液、分散液、贴片、胶粘剂、绷带、敷料、长效剂或储液囊。11....

【专利技术属性】
技术研发人员：S·库尔，V·纳卡姆，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡,SG